神经代谢疾病的基因治疗

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在过去的十年中，由于在载体设计，干细胞操作，调节方案和细胞载体递送方面的关键理解和创新，基因治疗领域经历了复兴。这些努力与采用新开发技术的前所未有的临床试验结果以及新型的学术-工业合作伙伴关系相结合。

人们对基于基因的方法治疗患有严重神经系统疾病的遗传性神经代谢疾病的兴趣不断增强。遗传性代谢疾病是由单基因疾病，由影响溶酶体或过氧化物酶体代谢活性的酶或结构缺陷引起。代谢缺陷可主要影响中枢神经系统，导致神经元死亡，小胶质细胞活化，炎性脱髓鞘和轴突变性。这篇综述概述了目前正在临床研究中的神经代谢溶酶体和过氧化物酶体贮积病（例如肾上腺皮质激素和异色性白细胞营养不良）的基因治疗策略，在全面阐述其主要特征和机制的基础上，提出了一种新的研究方法，基因疗法来治疗这些毁灭性疾病。遗传性代谢疾病是由一种或多种基因编码的单基因疾病，这些基因编码参与脂质或蛋白质代谢的酶或蛋白质。无法降解或合成特定的底物导致过量的未降解代谢物和下游缺乏必需的分子成分，这些分子最终会积累，从而导致细胞毒性和细胞死亡。这可能会影响多个身体组织，通常包括中枢神经系统（CNS），并导致广泛的临床表现。中枢神经系统受累可能很严重，并且会严重影响患者的不幸预后。其范围从小胶质细胞激活，炎性脱髓鞘和轴突变性到最终神经元死亡。基于基因的遗传性神经代谢疾病的治疗方法主要集中于溶酶体和过氧化物酶体贮积症（分别为LSD和PD），并伴有严重的神经系统疾病。过氧化物酶体是细胞器，高度参与超长链脂肪酸（VLCFA）的降解（β-氧化），过氧化氢解毒以及胆固醇，胆汁酸和缩醛磷脂的合成。由过氧化物酶体活性受损引起的典型疾病是X连锁肾上腺皮质营养不良（X-ALD）。在X‐ALD中，少突胶质细胞中发生大量的VLCFA积累，其中胆固醇代谢途径是必不可少的，并且非常活跃地产生髓磷脂，该分子衍生自该分子。髓磷脂产生的损害反过来导致中枢神经系统大量脱髓鞘和神经变性的区域。溶酶体是被认为可消化蛋白质，核酸，碳水化合物和某些脂质的细胞器。LSD是由酸性溶酶体水解酶，溶酶体膜蛋白或非酶溶性溶酶体蛋白缺乏引起的。分子缺陷最终导致未降解代谢物在溶酶体中最初积累，然后在整个细胞室中积累，从而改变了质膜的生理组成。膜相关蛋白在存储结构中的不适当隔离会阻止它们正常运输和功能，从而导致神经元和神经胶质细胞的细胞稳态和细胞信号的严重改变。神经变性PD和LSD的特征在于未降解的底物积累，氧化应激和神经发炎，这代表了神经变性和脱髓鞘的主要机理。它通常是由于驻留的小胶质细胞和星形胶质细胞的显着激活而发生的，其特征可以是在神经退行性病理的晚期募集渗透到大脑的周围巨噬细胞。全世界PD和LSD的发生率分别为1：20,和1：7,活产，占遗传代谢疾病的很大一部分。在大多数情况下，它们具有相似的临床表现，其特征是进行性神经功能缺损。特别是LSDs有多种临床表现，主要是基于储存物质的组织分布。在最严重的形式下，患者出生时看起来正常，并在不久后出现病理症状，包括智力低下，行为异常，认知和运动功能的逐步恶化以及全身异常。总体而言，LSD是小儿神经退行性疾病的首个病因，其特征是神经病理学无懈可击，通常是婴儿早期死亡的原因。迄今为止，还没有针对PD和LSD患者的有效疗法。这种未满足的医疗需求及其单基因性质使得这些疾病非常适合用于基于细胞和基因的疗法。在过去30年中，通过从健康相容供体移植同种异体造血干祖细胞（HCT）进行基于细胞的治疗，以阻止或遏制PD和神经退行性LSD的进展。其基本原理是，具有异体代谢能力的髓样细胞可重新填充包括中枢神经系统在内的患者组织，并恢复有缺陷的代谢活性以及正常的清除功能，从而有助于挽救储存并减轻组织损伤。对于由酶缺乏引起的LSD，同种异体骨髓细胞可能会在CNS中释放功能性溶酶体酶，这些受体可能会由受体的酶缺陷细胞通过位于细胞质膜上的6-磷酸甘露糖和其他甘露糖受体吸收。一种通常称为交叉校正的机制。尽管有这个理由，HCT在PD和LSD患者中的临床疗效还是有争议的，只有有限的几种病因治疗而显示出明显的益处。其中，X-ALD（ccALD）的儿童脑型和I型黏多糖贮积症（MPSI）是HCT疗效更高的条件，因此移植适应症更强。在其他情况下，报道的结果不一致且差，特别是对于疾病发作后移植的患者。在某些适应症中，例如球状细胞性白细胞营养不良（GLD，也称为Krabbe病）和异色性白细胞营养不良（MLD），某些患者在HCT后出现了较轻的疾病，特别是在症状发作之前或早期就被移植的患者。然而，越来越多的证据表明，当在疾病的晚期进行移植时，在这些情况下缺乏临床益处。值得注意的是，同种异体HCT仍然具有很高的死亡率和发病率，主要是由于移植物抗宿主病（GVHD）。即使在使用全白细胞抗原（HLA）完全匹配的供体或脐带血进行的同种异体HCT的最佳情况下，在完全清髓的适应性治疗方案中，儿童的死亡风险仍然接近10-15％，成人则略高。此外，尽管脐带血库数量不断增加，但与HLA匹配的细胞供体的可用性通常受到限制，并且等待时间过长。离体基因治疗（GT）基于转基因造血干祖细胞（HSPC）的自体移植。它被提议并广泛探索为在几种单基因条件下，包括PD和LSD的同种异体HCT的更安全，更有效的替代方法。离体GT克服了GVHD代表的同种异体HCT的最严重的免疫学限制，并且消除了接受者终生免疫抑制的需要。如今，慢病毒基因转移是在体外GT临床前和临床研究中将治疗性基因的多个副本递送到人HSPC中的选择性方法。HSPC的病毒转导可以在包括CNS在内的整个人体组织中，HSPC衍生的细胞中过表溶酶体酶的功能，从而可以对神经元和神经胶质细胞进行强有力的交叉校正，这在多项临床前研究和一项关键的临床试验中均已观察到用于神经退行性疾病的MLD。目前，慢病毒载体（LVs）被认为是最安全的用于临床应用的人HSPC基因转移的有效工具。通常在部分或全部清髓前移植条件下进行离体GT手术，以在骨髓生境中“创造空间”，以促进移植的HSPCs的植入。多项临床前研究表明，在细胞移植前，应用CNS穿透剂（如白消安）进行清髓疗法，对实现关键的骨髓植入至关重要，这对于HSPC衍生的骨髓细胞发挥治疗作用至关重要在PD和LSD中。LV来源于慢病毒，其最著名的代表是人类免疫缺陷病毒（HIV）。在自灭活（SIN）配置中，所有原始病毒基因和调节元件均被去除，转基因表达由位于内部位置的通常来自人类的外源启动子驱动。LV通常以单链RNA颗粒的形式生产，该颗粒用水泡性口炎病毒（VSVg）的包膜蛋白g假型化，以将原始HIV嗜性重新编程为多种人类细胞类型，包括HSPC。慢病毒基因组在转导后稳定地整合在宿主细胞基因组中，可以长期稳定地转基因表达，并可以在原始转导的HSPCs的分化后代中表达。根据特定的治疗需求，转基因表达可能受细胞特异性或组成型强或弱启动子调控。通过适当的载体设计，HSPC的慢病毒转导可在整个定型和分化的髓样和淋巴样HSPC后代中产生稳定的转基因表达，包括在离体GT后重塑CNS的HSPC衍生的髓样细胞。在全球范围内，迄今为止，在针对免疫缺陷，血红蛋白病，代谢性疾病和CART细胞的多种权威临床研究中，基于慢病毒的基因转移被证明是安全有效的，而没有任何与载体相关的副作用的证据。在2年初由于γ-逆转录病毒载体的基因毒性而出现严重的副作用后，人们进行了广泛的努力，以将LV设计为离体GT安全有效的工具。虽然γ-逆转录病毒整合优先发生在具有重要调控功能的基因的活跃调控元件中，即启动子和增强子，但LV具有完全不同的整合模式，而这些基因在细胞定型和细胞识别中具有关键的调控功能。排除调节元件，主要发生在有限的且可重现的细胞特异性基因亚群的内含子中，而该基因亚群未富含癌基因。独立于先天载体整合的偏见，独特的载体设计是避免遗传毒性的关键因素：强烈建议在GT应用中使用具有短程活性并驱动生理转录水平的人类来源的启动子，而不是像脾脏聚焦形成病毒启动子那样是强而长距离的反式激活病毒启动子。体内GT是一种用于神经退行性代谢疾病的有价值的基于基因的替代方法，它基于重组腺相关载体（rAAV）在全身或局部感兴趣的组织中的全身性直接给药。rAAV源自小型，无包络且非集成的AAV。由于其出色的转导效率和安全性，迄今为止，rAAV已在许多动物模型和多项临床试验中用于直接基因转移到CNS中。rAAVs的生物分布，细胞嗜性和转基因表达取决于特定的病毒衣壳血清型，给药途径和载体设计。传统上，CNS中最常用的用于基因转移的rAAV血清型是1、2、5、8、9和重组人（rh）10。通常，rAAV介导的基因转移在大脑中可以有效地靶向神经元，很少靶向星形胶质细胞，少突胶质细胞和小胶质细胞。为了在LSD中应用，这些载体通常通过实质内注射在大脑中注射，或通过脑室内（ICV）或脑池或腰椎鞘内注射,注射到脑脊液（CSF）中。特定的rAAV血清型，包括AAV9和rh10，具有穿越血脑屏障的能力，可在全身性给药后转导CNS。由于系统泄漏，局部rAAV施用到CNS中会导致非靶组织的转导和外周转基因表达，特别是在肝脏中的表达。这可能会触发免疫反应，从而可能降低或取消体内GT策略在患者中的治疗潜力。为了克服这一局限性，采取了几种策略，从瞬时免疫抑制到耐受诱导。特别是，在中枢神经系统指导的体内基因治疗之前，诱导肝介导的耐受性20或新生儿AAV介导的治疗性蛋白质系统表达的策略获得了重要的结果。X‐ALD是最常见的PD之一，由ABCD1基因突变引起，编码ATP结合盒亚家族D成员（也称为肾上腺白细胞营养不良蛋白（ALDP））。该蛋白质位于过氧化物酶体膜中，并促进VLCFAs进入要降解的过氧化物酶体。ALDP缺乏会导致VLCFA在中枢神经系统和所有身体组织中积累，从而导致广泛的全身和神经系统临床症状。在最严重的X-ALD形式中，该疾病的特征是儿童时期的脑部发作以及脑白质的快速和进行性脱髓鞘。患者的行为在大约7岁时就开始出现，并在最初的规律发展过程中表现出正常状态，并在10岁时从视觉，听觉和运动认知障碍迅速发展为植物生长状态。年，在先前报道该病晚期患者的治疗结果较差的临床结果之后，该研究首次报道了HCT对男孩早期脑性肾上腺皮质营养不良的有益作用。目前，同种异体HCT是男孩患有早期脑ALD的治疗标准。如果在神经和神经心理缺陷仍然很少且脱髓鞘受限的情况下进行，HCT可以阻止脑脱髓鞘和疾病进展，从而提供稳定的临床疗效。在典型情况下，脱髓鞘病变通常在细胞移植后持续约12-18个月，然后才停止。LSDs中由于酶缺乏引起的HCT（如MLD和GLD）导致大脑中缺陷细胞的酶传递和交叉校正，而X-ALD中功能异常的蛋白则是结构蛋白。因此，HCT在X‐ALD中的治疗作用不是基于交叉校正机制，而是基于细胞介导的机制。HCT可能会导致大脑中微胶质细胞功能异常的纠正，无论是否与VLCFA的积累直接相关，最终都可以通过恢复正常的清除功能来减少神经元死亡，并减少神经胶质增生和神经炎症，有利于神经保护环境。临床前研究已广泛证明，治疗后HCT获益的延迟可能是由于供体来源的细胞中的小胶质细胞置换缓慢。由表达人ALDP的LV转导的人CD34+细胞在NODDSCID小鼠中异种移植，迁移到小鼠脑中，并分化成表达人ALDP的血管周髓样细胞。在这些证据和同种异体HCT结果的支持下，Cartier等人最初开发了一种基于LV编码野生型ABCD1cDNA（CGhALD-LV）的离体GT策略。在第一个体外GT临床试验中进行了基于白消安的调节后，将治疗性LV转导的自体HSPC移植到两个进行性脱髓鞘，无HLA匹配或脐带血供体的ccALD男孩中。两名患者分别在14和16个月后脑脱髓鞘骤停，直到最近三年以上的随访均无疾病进展迹象。患者表现出多克隆造血重建，具有约9％至14％的多谱系基因标记，并且功能性ALDP表达与疾病稳定相关。总体而言，离体GT的临床获益可与标准同种异体HCT相媲美或更高。在取得这些令人鼓舞的结果之后，年（ClinicalTrials.gov编号，NCT）启动了一项更大的，多中心的II期临床试验。处于疾病早期阶段的患者已接受通过Lenti-D转导的自体CD34+细胞，LV与CGhALD-LV相同，在骨架中缺乏通常用于增强转基因表达的功能元件（伍德查克肝炎病毒转录后调控）元件）。对接受Lenti‐D的17名男孩的初步结果证实了最初的发现，其中88％的患者在中位随访30个月后仅表现出极少的残留临床症状。离体GT导致具有多谱系基因标记的多克隆造血重建，并且没有克隆偏斜的证据。表现出极快神经系统恶化的患者死于脑髓样重构所需的疾病进展，该因素仍然是治疗快速神经退行性疾病的主要临床挑战之一。这些结果于年5月获得了美国食品和药物管理局（FDA）授予GT产品（Lenti-D）突破性治疗的称号，用于治疗ccALD患者。最近已开展了以下III期试验（年1月，NCT）。总体而言，这些研究证明了基于HSPC的离体GT在ccALD中的治疗价值，并鼓励其转移至其他类似的神经退行性疾病。医院（美国波士顿）进行Lenti-D临床试验的同一位研究人员最近也开发了基于rAAV9的GT策略，用于治疗脊髓轴突病肾上腺髓质性神经病（AMN），这是由于ABCD1缺乏引起的神经退化，主要影响脊髓。有效的AMNGT的设计面临的主要挑战是，在整个脊髓中达到关键水平的基因校正水平，从而最大限度地减少可能导致毒性的CNS载体外漏。为此，研究人员开发了一种渗透泵，将治疗性rAAV输送到AMN小鼠的腰CSF中。该程序在脊髓和背根神经节中实现了有效的基因转移，从而使脊髓中的VLCFA含量降低了20％。该载体主要转导了星形胶质细胞，内皮细胞和神经元，其对周围器官特别是肝脏和心脏的系统性生物分布有限。在审查了这些初步数据之后，FDA现在鼓励研究人员着手针对AMN患者进行这种体内GT的临床实验（“进展报告：FlorianEichler博士的AMN基因治疗试验研究”，髓磷脂项目，年1月））。神经代谢疾病的成功疗法是基于在CNS中获得高水平的基因校正细胞嵌合体，再加上治疗因子的持续表达和广泛活性。将治疗基因的多个拷贝递送至适当的靶细胞并通过适当的启动子调节其表达是设计有效GT策略的关键方面。尽管治疗性酶的过表达被很好地耐受，并且可能在MLD的体外GT临床试验中获得临床益处，但过高酶的产生可能导致细胞毒性。一个例子是溶酶体半乳糖脑苷脂酶（GALC）的过表达，GLD有缺陷，并通过有助于控制关键生物活性鞘脂的细胞内含量来参与功能性HSPC生态位的维持。废除GALC活性（如在GLD中），或基因转移和超生理学GALC表达导致人类HSPC存活，克隆形成潜能和植入能力的改变。有趣的是，分化的造血细胞的超谱学GALC活性确实会引起任何毒性，这表明细胞特异性对正常溶酶体酶活性改变的敏感性可能。除了对特定酶失衡的潜在细胞特异性反应外，慢性未折叠蛋白反应介导了稳定蛋白过度表达引发的细胞毒性的一般机制。在最近的体内GT研究中，提示接受接受实质内注射表达N-β-乙酰基己糖胺酶的AAVrh8载体的猴子中观察到，这种细胞途径的激活与数量有限的大量转导的细胞偶联是引起急性神经毒性的主要原因。神经炎症是神经退行性疾病的常见标志，主要是由于细胞因子，趋化因子和促凋亡分子大量释放而造成的神经毒性环境而导致神经变性。小胶质细胞和星形胶质细胞的活化程度通常在神经元丧失区域之前并预测其发生。如果内源性激活的小胶质细胞被认为是LSD和其他神经退行性疾病中神经退行性变的主要决定因素，则至少在两项成功的体外GT临床试验中，已证明HSPC衍生的具有酶活性的小胶质细胞是治疗作用的主要介质。适用于ALD和MLD。对于这一关键作用，小胶质细胞代表着通过终止神经变性并介导其他基本治疗作用（如将中枢神经系统环境从神经毒性转变为神经毒性）达到重要治疗作用的主要目标。为了实现这一目标，必须将HSPC衍生的酶感受态小胶质细胞强健植入到经过适当预处理的受体中。在这种情况下，也可以利用转基因的小胶质细胞来局部产生具有神经营养和抗炎能力的其他疾病调节分子，并恢复正常的清除和免疫监视功能。预览时标签不可点