综述蛋白质组学在死后肌肉中发现与肉

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肉的品质通常受到肌肉向肉的转化过程中发生的生理生化和代谢变化的影响。这些变化主要包括pH值降低、肌原纤维蛋白降解、蛋白质氧化和蛋白质翻译后修饰。肉品的嫩度、色泽、持水性和pH值等常规方法结果仅用于评价当时的肉质，但这些工具无法确定影响肉质变化的机制，也无法预测未来肉质的变化。

01宰后陈化对肉品质性状的影响

死后肌肉转化过程中的生理、生化和代谢变化涉及许多生物学途径。例如，肌原纤维蛋白降解、翻译后修饰、代谢酶的变化、肌红蛋白的化学状态、热休克蛋白的产生和凋亡对最终的肉质性状，特别是嫩度、颜色和WHC有显著影响。

嫩度

除了屠宰前的因素，如品种、性别、年龄、动物的饲养制度、营养状况和屠宰前的压力外，肉的嫩化还受冷却、屠宰体挂起、老化时间和烹调方法的影响。然而，最终的压痛取决于死后肌肉中关键肌原纤维蛋白质的蛋白质水解速率和程度。有研究利用液体等电聚焦（OFFGEL）发现肌钙蛋白T、热休克蛋白β-1、肌酸激酶、肌动蛋白、肌钙蛋白C、肌球蛋白1和2、肌球蛋白-1可作为肉嫩度的标志物。研究发现，RPPA的使用量化了牛肉宰后早期的29种蛋白质生物标志物，其中肌球蛋白重链-1（MHC-1）和视网膜脱氢酶1（ALDH1A1，氧化酶）区分了嫩肉和硬肉，并被确认为牛肉质地的主要生物标志物。因此，近年来蛋白质组学作为一种相关的技术被用来分析死后衰老过程中蛋白质的变化，揭示肉嫩度的蛋白质生物标志物。

肉色

屠宰前，肌红蛋白和血红蛋白是主要的色素蛋白，但屠宰后，大部分血红蛋白随血液流失，肌肉内的肌红蛋白是决定肉色的关键物质。肌红蛋白含量和物理化学状态在决定肉色方面起着关键作用。有研究分析鉴定出21种与牛肉颜色相关的蛋白质生物标志物，其中一些涉及肌肉收缩、代谢、热应激和凋亡。有研究研究了宰后贮藏（0、5、10和15天）牛肉的肉色参数与肌浆蛋白质组之间的关系，发现甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、果糖二磷酸醛缩酶A亚型（ALDA）、糖原磷酸化酶（PYGM）、过氧化物酶2（PRDX2）、磷酸葡萄糖变位酶1（PGM1）、超氧化物歧化酶（SOD）和热休克同源蛋白（71kDa）可作为肉色稳定性的预测因子。

02蛋白质组学方法鉴定潜在生物标志物

HSPB1、HSPB6和αB-晶体蛋白可作为嫩度的生物标志物。烯醇化酶3（ENO3）、HSPB1和CRYAB可作为肉色的生物标志物。TPI1、丙酮酸激酶同工酶M1/M2亚型（PKM2）、HSPB1和HSPA1B是常见的嫩度、色泽和WHC的生物标志物。这些潜在的蛋白质生物标志物属于六种不同的生物学途径：代谢酶、热休克蛋白、氧化蛋白、结构蛋白、凋亡和信号转导以及蛋白质水解。

应用蛋白质组学发现肉质性状生物标志物的工作流程一般来说。

代谢酶

与肉质密切相关的死后能量代谢受pH值降低的影响。在骨骼肌中，大约三分之一的蛋白质是由可溶性蛋白质和酶组成的肌浆蛋白，参与调节死后肌肉理化特性的许多生物过程。这些细胞成分用于在死后阶段产生能量。一些与肉质有关的代谢酶的蛋白质生物标志物，如GAPDH、TPI1、PKM2、PYGM、PGM1、烯醇化酶3（ENO3）、磷酸甘油酸激酶1（PGK1）、乳酸脱氢酶A（LDH-A）、乳酸脱氢酶B（LDH-B）、醛酸、ALDH1A1、肌酸激酶M型（CKM）、苹果酸脱氢酶（MDH1）、乌头酸水合酶（AC02）、NADH脱氢酶（NDUF）。在牛肉中发现了UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶（UGP2）、ATP合酶亚单位β、线粒体（ATP5B）和β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1（ST6GAL1）。在猪，羔羊中发现了GAPDH、TPI1和ENO3；鸡肉中发现了TPI1和PKM2，鹅中发现了GAPDH和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。在这些生物标记物中，GAPDH、PYGM、PGK1、LDH-A、LDH-B、alda、ALDH1A1、CKM、MDH1、PKM2、TPI1和ENO3蛋白质影响肉的嫩度。

肉色的潜在蛋白质生物标志物包括GAPDH、PKM2、TPI1、ENO3、PYGM、PGK1、PGM1、LDH-A、Aldo、ALDH1A1、CKM、AC02和NDUF，而GAPDH、TPI1和GSH-Px蛋白质可作为WHC的潜在生物标记物。影响肉质性状的蛋白质生物标志物主要是糖酵解酶，如GAPDH、PKM2、TPI1、ENO3、PYGM、PGM1、PGK1、LDH-A、LDH-B、GSH-Px和AC02。糖酵解是影响死后肌肉品质的重要生化途径。死后肌肉中的糖原含量影响糖酵解的速度和程度，从而导致乳酸含量和pH值的变化，最终影响嫩度、滴落损失和肉色。同时，一些氧化代谢的蛋白质生物标志物是ALDA、ALDH1A1和CKM。与线粒体和ATP再生相关的氧化酶影响肉质。GAPDH和TPI1蛋白质可以同时表征肉类的颜色、嫩度和WHC。

GAPDH是糖酵解过程中的一种关键糖酵解酶，与ATP合成密切相关，存在于细胞膜、细胞质和细胞核中。以往研究发现，GAPDH水平与剪切力呈负相关，与肌节长度和MFI呈正相关，可能的原因是GAPDH会影响肌原纤维蛋白降解。此外，线粒体膜中的GAPDH和VDAC-1蛋白的结合可以触发线粒体中细胞色素C和凋亡诱导因子的释放，从而诱导细胞凋亡。同时，GAPDH可作为与肉色相关的生物标志物，因为它在糖酵解过程中，在辅酶因子NAD和无机磷酸的参与下，催化3-磷酸甘油醛转化为1，3-二磷酸甘氨酸，反应产生的氢离子与NAD反应生成NADH。因此，NADH可以通过促进肌红蛋白的降低来改善死后肌肉中肉色的稳定性。GAPDH对WHC的影响可能是由于GAPDH也是一种糖酵解酶，糖酵解速率对酸化过程（乳酸和质子积累）起积极作用，并且pH值迅速下降，从而导致类似浅软渗出（PSE）的情况。

TPI1在糖酵解途径中起重要作用，是生物体内产生能量的必需酶。TPI1的可逆反应在糖酵解过程中催化二羟丙酮磷酸和甘油醛3-磷酸的相互转化。TPI1水平与牛肉和猪肉的肉质嫩度相关。其机制可能是TPI1是一种糖酵解酶，在能量产生中起重要作用。TPI1，包括其磷酸化形式，进一步与死后肌肉pH下降率有关，导致乳酸和氢质子的积聚，这些质子将减少肌原纤维和丝蛋白的静电排斥，从而促进肌肉纤维的横向收缩和肌节的延长，最终改善肉的嫩度。TPI1可作为肉色的蛋白质标记物，因为磷酸肌酸的消耗会改变厌氧代谢，厌氧代谢中的各种底物可进一步转化为乳酸，从而影响肉色。据报道，低WHC肉中TPI1的表达增加，TPI1的作用机制可能与前面描述的相同。同时，屠宰前应激对肉质有不良影响，可导致肉牛DFD的发生。与正常肉类相比，DFD中的TPI1蛋白水平增加。这可能是因为更高水平的糖酵解酶（如TPI）可以催化二羟基丙酮磷酸和甘油醛3-磷酸的相互转化，这与牛和猪肌肉的嫩度有关。因此，TPI1可以作为肉质性状的生物标志物来表征和预测肉质。

热休克蛋白

热休克蛋白是机体对高温、缺氧、缺血、氧化等应激反应产生的一组伴侣蛋白。重要的是，细胞内的非保护性蛋白质在细胞存活中起着重要的作用。根据氨基酸序列、分子量和功能的同源性，热休克蛋白可分为6个家族，分别是HSP、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小HSP家族（sHSPs）（12-43kDa），主要包括HSPB6、HSPB1和αB-晶体蛋白。HSPB6、HSPB1和CRYAB首次被提出作为屠宰前应激（PSS）的生物标志物，这可能是因为：应激可诱导保护性蛋白质的合成，如热休克蛋白，以保护细胞蛋白质不致变性，并可能导致活体动物功能丧失。

HSPB1、αB-晶体蛋白和HSP70-1A/B可作为表征牛肉嫩度、颜色、WHC和DFD状态的蛋白质生物标志物。

HSPB1是细胞对外界刺激做出反应时维持和修复的重要组成部分。调节肌动蛋白和肌动蛋白之间的相互作用，以及肌动蛋白和肌动蛋白之间的相互作用。因此，一项研究发现，HSPB1在肉中的表达上调有利于肌动蛋白和肌球蛋白的水解，有助于改善肉的嫩度。此外，细胞凋亡与细胞收缩和失水密切相关，HSPB1通过调节细胞凋亡和细胞内空间来影响保水性。先前的研究发现，在深色肉类样本中，HSPB1过多，因为它可以防止肌肉到肉转化过程中的蛋白质聚集和变性。

HSP70-1A/B是HSP70家族中高度保守的蛋白质，具有分子伴侣、细胞保护、抗凋亡、自身免疫和免疫调节等多种生物学功能，与肉的嫩度相关，因为HSP70的上调维持了肌肉细胞的完整性并修复了变性蛋白质。HSP70-1A/B可通过影响细胞凋亡、蛋白质水解和氧化应激途径影响L*、A*和B*颜色值。HSP70具有抗凋亡和分子伴侣功能，能保护肌动蛋白和微管蛋白等多种结构蛋白不被降解。HSP70与肉的WHC呈正相关，可作为评估和预测死后肌肉WHC的生物标志物。

氧化蛋白

蛋白质氧化是指在体内外条件下，某些特定氨基酸残基在自由基和相关氧化物的作用下发生的反应。蛋白质氧化改变蛋白质的结构和功能特性，增强蛋白质对氧化物的亲和力，促进蛋白质的水解、聚合和交联；破坏细胞功能，有时甚至导致细胞凋亡。蛋白质氧化是死后肌肉向肉转化过程中普遍存在的现象。在死后衰老过程中，肌肉受到活性氧（ROS）的攻击，导致肌肉组织氧化能力增强，抗氧化能力下降。同时，蛋白质氧化破坏氨基酸结构，导致蛋白质聚集和相关酶活性降低。蛋白质氧化会影响肉的颜色、嫩度和WHC，peroxiredoxin-1（PRDX1）、PRDX2、peroxiredoxin-6（PRDX6）和DJ-1（PARK7）蛋白与肉质嫩度相关，可作为预测和评价肉质的潜在生物标志物。PRDX1、PRDX2和PARK7蛋白是降解过氧化氢的关键，过氧化氢是在死后肌肉中新陈代谢过程中产生的，这些蛋白主要通过改变肌原纤维蛋白的降解来影响肉的嫩度。PRDX1和PRDX2水平与肉的嫩度呈正相关，然而，PARK7作为ROS的猝灭剂，对肉的嫩度有负作用。PRDX6具有双重酶活性，充当磷脂酶A2和过氧化物还原酶。PRDX6被证实在嫩肉中含量更高，并且PRDX6参与保护细胞免受氧化应激的影响，氧化应激可以释放氧自由基并形成蛋白质聚集体，这些聚集蛋白抑制肉的嫩化。

PRDX6、PARK7和SOD蛋白也与肉色有关。PRDX6有助于保持牛肉的颜色稳定性，因为PRDX6通过与肌红蛋白竞争氧气来抵消肉的变色过程。PARK7可在氧化应激下氧化和转移线粒体，并作为一种传感器防止氧化应激诱导的毒性和抑制线粒体降解。PARK7与不同肌肉、品种和物种的肉色参数呈负相关。超氧化物歧化酶（SOD）与肉色参数a*值呈显著正相关，在肉色不稳定样品中呈下调趋势。超氧化物歧化酶（SOD）能消除过量的超氧阴离子，阻断自由基对细胞的损伤，从而防止有害过氧化氢的形成，保护肌红蛋白氧化还原状态比率的稳定性。因此，SOD可作为肉色稳定性的潜在标志物。由于蛋白质氧化可导致细胞间隙的扩大，并作为水分扩散的通道，SOD也可以作为预测肉的WHC的潜在标记物。

结构蛋白

在死后衰老过程中，许多肌原纤维蛋白被内源性酶降解，如凋亡酶和钙蛋白酶。这些蛋白质的降解影响肉质性状，尤其是肉质嫩度。已鉴定的与牛肉有关的蛋白质有α-肌动蛋白（ACTA1）、TITIN（TTN）、MHC-1、肌球蛋白轻链3（MYL3）、肌球蛋白重链IIx（MyHCIIx）、微管蛋白α-4A链（TUBA4A）、肌钙蛋白T、慢骨骼肌（TNNT1）、肌钙蛋白T、快速骨骼肌（TNNT3）、肌钙蛋白C（TNNC1）、capZ-b（CAPZB）、CAPZA2、结蛋白（DES），肌球蛋白轻链1（MYL1）、肌球蛋白调节轻链2、快速骨骼肌异构体（MYLPF）、肌球蛋白7（MYH7）、组蛋白H2A.J（H2AFJ）、cofilin（CFL）和原肌球蛋白（TM）、TTN和TM在猪中被识别。DES、MYL1、CFL和角蛋白（KER）在鹅中被鉴定，ACTA1和MYL3与鸡和鹿有关。在这些蛋白质生物标记物中，DES、CAPZB、ACTA1、TTN、TUBA4A、TNNT1、TNNT3、TNNC1、MYL1、MYL3、MHC-1和MyHCIIx蛋白与肉嫩度有关。ACTA1、TTN、MYL3、MHC-1和MyHC-IIx蛋白质与肉色有关。DES、ACTA1、TTN、MHC-1、KER、CFL和TM蛋白质可用于预测肉类的WHC。ACTA1、MYL3、TNNT3、TNNC1、CAPZA2、MYL1、MYLPF、MYH7和H2AFJ可能是DFD肉的潜在蛋白质生物标志物。其中ACTA1和TTN可以同时表征嫩度、色泽和WHC。

ACTA1可以与许多其他蛋白质相互作用，特别是在肌肉收缩中起主要作用的粗肌丝。在死后衰老期间，肌原纤维蛋白水解产生的肌动蛋白片段可作为蛋白质水解的分子标记物。ACTA1与肉的嫩度有关，因为肌球蛋白和肌动蛋白是粗肌原纤维及其微丝的主要成分，因此这两种蛋白质相互紧密结合，影响肉的嫩度。ACTA1也是一种与肉色相关的结构蛋白，ACTA1水平可以清楚有效地区分牛肉的三种颜色等级（淡红色、浅红色和深红色）。由于水解和降解引起的蛋白质的超结构变化可能通过影响光散射来影响肉的颜色。ACTA1仅在DFD肉中被Fuente-Garcia等发现，主要是因为DFD肉的pH值（超过6.0）远高于肌动蛋白的pI（5.23），提高了其溶解度，并使这种蛋白质在应激动物的可溶性提取物中的存在更加显著。

TTN分子将肌节的一半从Z线（N端）延伸到M线（C端），并保持肌原纤维的完整性和稳定性。TTN与牛肉的嫩度和多汁性呈正相关，因为TTN在屠宰后立即发生部分降解，并且在死后24小时内进一步降解。因此，我们推断这种降解会影响肉质和最终肉质。先前的研究报告称，TTN与肉色参数a*、b*、C*和h*值呈负相关，但与L*值呈正相关。这主要是由于TTN降解导致肌原纤维结构完整性丧失，导致细胞内结合水流出，从而影响光散射和肉色。然而，TTN影响肉色的确切机制仍不清楚。另一项研究表明，滴水损失率与TTN完整性之间存在正相关，这可能是由于蛋白质降解增加，阻碍了肌肉纤维的收缩。

在骨骼肌中，肌球蛋白重链（MHC）是最重要的肌原纤维蛋白。这些酶催化与肌肉收缩相关的反应并维持肌肉细胞结构。根据骨骼肌的收缩速度，MHC可分为肌球蛋白重链Ⅰ（MHCⅠ，慢氧化纤维）和肌球蛋白重链Ⅱ（MHCⅡ，快速氧化纤维）。研究表明，MHCⅠ与肉质嫩度呈正相关，可作为预测肉质的潜在生物标志物。这可能是因为蛋白质水解可诱导肌丝降解，改善肉的嫩度。MHC降解的机理尚不完全清楚。与肌肉纤维类型直接相关的细胞酶设备。红色纤维比例较高的肌肉线粒体浓度较高。负责耗氧量和肌红蛋白还原活性的酶系统是位于线粒体中的电子传递链的一部分，最近有人认为这与牛肉颜色有关。例如，肌肉中慢氧化纤维（MHC1）的含量与L*值呈负相关，这可能是由于其较高的肌红蛋白含量和糖酵解潜力。此外，这些纤维中MyLC-1F的含量更高，MyLC-1F是肌球蛋白轻链家族的一员，Li-1F-C等在肉类发育中起重要作用。

蛋白质水解

钙蛋白酶是一种钙依赖性半胱氨酸蛋白酶，参与蛋白质水解。μ-calpains和m-calpains的活性分别需要微量和毫摩尔浓度的Ca2+。两种蛋白酶在死后均与多种生物途径的蛋白质相互作用，如Ca2+内稳态、蛋白质结构、葡萄糖代谢、热应激、线粒体和凋亡。此外，发现μ-calpains和m-calpains是通过蛋白质组学评估和预测牛肉嫩度或颜色的合适生物标记物。μ-calpain与Prdx6一致相关。PRDX6是一种具有谷胱甘肽过氧化物酶和磷脂酶A2（PLA2）活性的双功能蛋白质，PRDXs是一种将过氧化氢转化为水的抗氧化酶，可通过氧化、磷酸化和蛋白质水解进行调节。抗氧化酶，如PRDX6，可以保护蛋白酶，如μ-calpain。Hsp70-1A/B和μ-calpain与L*、a*和B*值相关。Hsp70-1A/B是诱导型Hsp70家族的一员，在细胞应激反应中被大量诱导。这可能是因为它能够保存蛋白质。因此诱导性Hsp70s和μ-calpain相互作用影响肉色。ROS损伤细胞内质网导致死后胞浆内Ca2+释放，激活μ-calpain。结构蛋白是μ-calpain的主要底物，这些蛋白质影响肉色。此外，可诱导的Hsp70可能会干扰这一过程。死后，氧化应激由脂质过氧化产物4-羟基-2-壬醛（4-HNE）、α、β-不饱和醛引起Hsp70的羰基化，从而使其失活。研究还发现，μ-calpain与牛肉的b*和h*值呈负相关，这可能是由于μ-calpain和其他蛋白酶（如caspases）对蛋白质的降解，导致肉的原始结构发生深刻的超微结构变化，从而影响肉色。

细胞死亡与信号传导

有一些与肉质有关的生物途径，如细胞死亡和信号传导。FHL1蛋白是一种细胞骨架相关蛋白，属于LIM超蛋白家族的FHL蛋白家族。LIM结构域是一个蛋白质相互作用基序，参与连接蛋白质与肌动蛋白细胞骨架和转录机制。由于FHL1主要在骨骼肌中表达，与之相互作用的蛋白质表明FHL1在肌肉发育、结构维持和信号传导中起着多功能和整体的作用。这些FHL1相互作用物可映射到各种不同的功能类别，包括结构蛋白、信号转导、转录调节器、受体和通道。FHL1被认为是骨骼肌质量的调节因子，通过与钙调神经磷酸酶调节的转录因子NFATc1结合来增强骨骼肌的强度。在成熟骨骼肌中，FHL1定位于I-带，包括Z-线，暂时位于M-线，其中部分延伸到A-带的C-区。由此产生的横向条带图案为交替的厚带和薄带，分别对应于I带和A带的中心人。因此，FHL1局限于骨骼肌的Z线，从肌原纤维中释放完整的α-肌动蛋白，并在肉嫩化过程中导致Z线的减弱。FHL1与牛肉颜色有关，可能是由于FHL1和代谢酶之间的相互作用对缺氧和氧化应激作出反应，从而影响糖酵解。此外，TRIM72是一种在骨骼肌中表达的信号蛋白，参与细胞凋亡并在膜损伤中充当氧化传感器。在硬牛肉中含量更高，在凋亡途径中起主要作用，消除了凋亡过程中的有害物质，在凋亡阶段其水平降低，这解释了其与肉嫩度的负相关。TRIM72与L*值之间的负相关肯定了这种蛋白质的抗氧化特性。

03结论和未来趋势

代谢酶（GAPDH和TPI1）、热休克蛋白（HSPB1）和结构蛋白（ACTA1和TTN）可能是未来良好的生物标志物。

GAPDH是糖酵解途径中的关键酶，与ATP合成密切相关。GAPDH在几乎所有组织中都高度表达，在同一组织或细胞中其表达通常相对恒定，因此经常被用作研究其他基因和蛋白质表达的内部参考。GAPDH可作为牛肉、猪肉和鹅的嫩度、颜色和WHC的潜在生物标志物，并受死后老化和逐步冷却的影响。因此，GAPDH可作为未来评价和预测不同肉质性状的生物标志物，也有助于更好地了解死后代谢过程中发生的多种生物学途径。

TPI是存在于许多生物体内的糖酵解酶。TPI是糖酵解第一准备阶段的最后一种酶，它催化d-甘油醛3-磷酸从磷酸二羟丙酮的可逆转化，从而维持这两种磷酸三糖的平衡。TPI1在糖酵解途径中起重要作用，它通过影响糖酵解途径影响肉的嫩度、色泽、WHC和DFD状态。到目前为止，TPI1已被证明是评估牛肉、猪、鸡肉和牦牛肉嫩度、颜色、WHC和DFD状态的潜在生物标记物，并已确定其复杂的代谢途径。因此，TPI1可作为肉质性状的生物标志物，用于肉质性状的表征和预测。此外，肌肉收缩和热应激也是屠宰后肌-肉转化过程中必不可少的生物途径，直接影响肉品品质。

HSPB1和TTN也被确定与牛肉的肉质嫩度、颜色和WHC有关，而ACTA1和TTN也在鸡肉中发现和猪。因此，GAPDH、TPI1、HSPB1、ACTA1和TTN可作为评价和预测肉质性状的良好生物标志物。

[文献来源：Proteomicsdiscoveryofproteinbiomarkerslinkedtomeatqualitytraitsinpost-mortemmuscles:Currenttrendsandfutureprospects:Areview,TrendsinFoodScienceTechnology.,,-].

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