PNH阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式检

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PNH疾病特征

原因：PNH是罕见体细胞突变（X连锁的PIG-A基因）引起的造血干细胞异常，影响所有系别的血细胞。

结果：

1、完全或部分缺失通过GPI锚链在细胞膜上的蛋白（如CD55、CD59等）

2、以补体介导的血管内溶血为特征，在非常见点有高风险的血栓

发病人群：

1、可能在任何年龄诊断出（中位年龄在30s早期）

2、获得性疾病（每年每百万人群中有1.3例新增）

3、是会持续很多年的慢性病

4、近年来，针对终末补体蛋白C5的人性化的单克隆抗体Eculizumab的成功开发和临床试验提高了溶血性PNH病人的生活质量。（减少了溶血、血栓形成和输血的需要）

PNH的免疫学特点

?在补体级联反应中，CD55抑制C3转化酶的形成和稳定

?CD59抑制补体膜攻击复合物的组装

?CD55、CD59影响着补体敏感的红细胞，在PNH中，其缺失造成了急性和慢性的血管内溶血

早期的PNH的诊断方法

PNH起初被识别为一种溶血性贫血，所以早期的诊断方法聚焦于红细胞方面

PNH的FCM鉴定历史、意义

?PNH的FCM鉴定始于

?年成为鉴定GPI缺陷细胞的方法

?PNH的FCM分析成为日益重要的疾病的进程、转归、缓解、及对现代治疗方法（使用抗补体系统中的C5单克隆抗体）的响应的监测方法

?补充的高敏方法可以筛查PNH微小克隆(1.0%)和再生障碍性贫血或MDS病人中有PNH表型的细胞(0.1%)

国际PNH兴趣小组对PNH分类

?经典PNH：包括溶血和血栓病人

?有其他原发性疾病的PNH：比如再障和MDS

?亚临床PNH：病人有小PNH克隆，但没有溶血或血栓形成的临床或实验室证据

临床提示

?尽管只有少数PNH病人会出现血红素尿，但如果解释不清原因，需要检测PNH。

?是否要检测有溶血证据的病人尚有争议，但抗体介导的Coombs阳性的溶血性贫血在其他症状缺乏的情况下不用检测，Coombs阴性的溶血性贫血病人要进行PNH常规排查，尤其是没出现特征的细胞异常（如球形红细胞、镰状细胞、裂片红细胞等）和没有明显感染引起的溶血。PNH病人慢性的血管内溶血，会通过尿路排出时丢失铁。

?血栓是PNH的常规并发症，约占40%，PNH的病人不常呈现这种形式，血栓症或血栓栓塞在一个系列中约占5%的病人，可是PNH病人更可能发生非常见点的血栓（包括布加综合症或脑血栓），因此非常规血栓需要进行PNH检测。

?同时出现血栓和血管内溶血或血细胞减少也需要检测PNH

?不出现溶血通常可排除经典PNH

?其他形式的PNH按照定义没有溶血，所以不能把PNH仅限于溶血病人身上

?血细胞减少的年轻人（需要鉴别诊断再生障碍性贫血和发育不良的贫血）需要排查PNH克隆，单独贫血很少需要PNH检测，除非全面检查后没有发现贫血原因。

?I-PIG建议再障贫血或骨髓增生异常的难治性贫血应该用高敏方法每年排查一遍PNH，但没有制定具体的灵敏度阈值。

检测频率

?如果确诊PNH后应该定期监测PNH克隆大小，病情稳定后可进行年检

?接收eculizumab治疗的病人有必要进行PNH常规监测，频率不统一

?在初始检测没有测到PNH克隆时，血栓或溶血的经典PNH疑似病人不需要连续检测

?有PNH小克隆的再障贫血病人需要连续检测，因为病人可能会从再障贫血发展到溶血性PNH，可在克隆大小增加上进行预测

标本考虑

?最好选择外周血，骨髓标本不合适（红细胞和白细胞成熟中GPI锚链蛋白会变化）

?MDS病人中的PNH检测也很难解释，会有一些MDS相关的GPI锚链蛋白的异常，最常见的是CD16的缺失

?EDTA是最常用的抗凝剂，肝素和ACD也可以

?样本运输同常规的实验室运输条件

?红细胞建议48小时内测，白细胞建议24-48小时内测

PNH的FCM检测：RBCs(红细胞）

GPI锚链蛋白的选择：

1、在大部分病例中，单一标记可以轻易测出PNH克隆，罕见会出现CD55、CD59先天缺失的病例

2、CD59在红细胞表面较高水平表达，可用于各种荧光素标记的抗体来鉴定，一些克隆会较好的区分III型和II型细胞，不建议间接标记

3、CD55在红细胞表面表达丰度较少，常不能充分的区分II型细胞，不推荐作为唯一的试剂。

4、滴定抗体（因为高浓度的抗红细胞抗体会引起细胞聚集），尤其是同时使用CD55、CD59时(可在同一管中用不同颜色同时标记CD55、CD59)

5、避免使用IgM抗体或间标抗体

6、CD58虽然也是通过GPI锚链在红细胞上的蛋白，但是其也有跨膜蛋白型，不易解读结果，相比CD55/CD59也没有太大优势

局限性：单独检测红细胞是不够的，因为有些PNH病人由于溶血和输血会低估PNH的克隆大小，所以需要同时检测白细胞的PNH克隆

优势：

①相比WBC的PNH检测，II型细胞更容易用RBC检测到

②同时比较红细胞和白细胞克隆的相对大小可提供有用的临床信息

显示方法：

Histogram:便于比较正常和缺陷细胞，异常克隆细胞足够多时，利于II型和III型号的独立鉴定和定量

Dotplot:当异常克隆细胞数量较少时，方便圈门和定量

?关于圈门：用logFSC/logSSC进行圈门分析红细胞，去除碎片和血小板

?关于圈门抗体选择：加入CDa抗体，可以特异识别RBC，防止其他系别细胞或碎片被误认为有缺陷的RBC

?关于III型细胞的界限：可用正常或PNH病人非染色组来鉴定

?关于II型细胞的界限：III型和II型之间

?关于I型细胞的界限：需要用正常人的全染色组来鉴定

?关于输血后的病人：可能会和受者的GPI锚链蛋白的表达强度轻微不一致，因此可能会出现独立的重叠的群体

?关于样本制备：红细胞在外周血中含量丰富，故使用少量全血稀释液检测，且不能使用溶血素

?关于抗体滴定：红细胞抗体需要滴定（选择达到合适区分度的最低抗体量），以防止红细胞凝集

?关于清洗不充分：会出现III型细胞误读为II型细胞的情况（如下如）

1管1色PNHRBC分析

样本制备

①取50ul外周血稀释液(10μLPB+1mLPBS)加入适量抗体轻柔混匀，室温避光孵育30min

②用PBS洗两遍细胞（洗细胞的作用：a.可以减少红细胞凝集；b.能减少抗体的非特异性结合，减少II型和II型的区分难度），最好用窄孔滴管重悬细胞沉淀

③用0.6mLPBS重悬细胞后上机检测（上机检测的仪器最好有混匀样本功能的装置，可以防止细胞聚团）

上机分析

?以logFSC/logSSC圈门收集红细胞5万个（个红细胞足够检测1%的群体）

?通过CD59阴性(typeIII)或部分阳性(typeII)来评估PNH克隆

1管2色PNHRBC分析

样本制备同上

上机分析

?以logFSC/logSSC/CDa圈门收集红细胞5万个

?通过CD59阴性(typeIII)或部分阳性(typeII)来评估PNH克隆

PNH的FCM检测：WBCs(白细胞）分析

?淋巴细胞由于长的寿命和GPI锚链蛋白的可变表型，不适合作为监测靶标

?中性粒细胞和单核细胞是合适的监测靶标，且两者测得的克隆大小相似，一起监测可以互为验证，增加了诊断的可信度

?中性粒细胞的PNH克隆最早先也是用CD55和CD59检测的，可是他们没有其他GPI锚链蛋白（如CD16、CD66b、CD24)区分阴阳性的效果好（CD55和CD59测得的CV大、克隆较小）

?嗜酸性粒细胞不表达CD16，骨髓发育不良粒细胞丢失CD16，CD16具有多态变异，不被某些CD16抗体识别

?CD14是表达在单核细胞上的GPI锚链标记，用于检测单核细胞的PNH克隆，某些不成熟的单核细胞和DC细胞会丢失，所以在小克隆的检测上会受限制

?CD55（不是CD59)在单核细胞相对较高表达，可以用来检测单核细胞的PNH克隆

?FLAER特异地锚链在GPI锚上，因此在GPI锚缺失的粒细胞和单核细胞上不表达，是检测白细胞PNH克隆最有用的试剂，早期是冻干粉状试剂，限制了其在实验室的使用，现在的试剂会更稳定，也有液体试剂，需避光，2–8度保存

?系别标志可以防止骨髓发育不良或单核细胞较少等情况下不能使用FSC/SSC进行圈门，且增加圈门的纯度

?大克隆可以使用单一GPI锚链标记或FLAER进行单参数histogram鉴定，大多数病例最好使用两个不同的标记进行散点图十字门或矩形门的鉴定，有时II型粒细胞会被鉴定出，尤其是使用FLARE时，需在结果报告中指出，计算粒细胞的PNH克隆时，需联合II型和III型克隆。

WBCs(中性粒细胞和单核细胞）

样本制备

1.取ul混匀的外周血加入预混抗体

2.4-8°C避光孵育30min

3.加入2mL新配置的氯化铵溶血素室温避光孵育10min

4.用PBS/PBA洗两遍细胞

5.用0.6mL等渗溶液重悬细胞后上机检测

上机分析

1.WBCs的中性粒细胞以FSC/SSC/CD45/CD15圈门，单核细胞以FSC/SSC/CD45/CD64圈门

2.收集中性粒细胞5万个(5千-1万的感兴趣细胞可达1%以上的灵敏度，由于单核细胞数量较少，所以少收集点也可以，尤其是和粒细胞的PNH克隆大小一致时），PNH克隆通过中性粒细胞上的FLAER、CD24，单核细胞上的FLAER、CD14检测

1管5色PNHWBC分析

样本制备同前

上机分析

?WBCs的中性粒细胞以FSC/SSC/CD15圈门，单核细胞以FSC/SSC/CD64圈门

?收集中性粒细胞5万个，PNH克隆通过中性粒细胞上的FLAER、CD24，单核细胞上的FLAER、CD14检测

1管6色PNHWBC分析

样本制备同前

上机分析

?WBCs的中性粒细胞以FSC/SSC/CD45/CD15圈门，单核细胞以FSC/SSC/CD45/CD64圈门

?收集中性粒细胞5万个，PNH克隆通过中性粒细胞上的FLAER、CD24，单核细胞上的FLAER、CD14检测

PNH的FCM检测：高敏检测的意义

1.随着流式细胞术的发展和稀有细胞的检测的使用增加，可以检测越来越小的异常细胞群体，高敏检测在指南中是指能够检测不超过0.01%克隆的方法，比常规检测困难。

2.在稀有细胞检测中，关键是限制假阳性群体，获取足够的鉴定特征表型的细胞，评估鉴定靶细胞的多个指标，其他挑战还包括非特异性结合、自发荧光、来自前一个标本的交叉污染、错误的数据突发帧。

3.经典的PNH诊断不需要高敏检测，但对于骨髓识别异常的患者的小PNH群体的检测很重要。

4.在再生障碍性贫血的有效免疫抑制剂治疗的并发症中通常会出现PNH，大部分的再生障碍性贫血的病人和某些RUCD的病人会出现PNH。某些带小群体的病人的PIGA基因测序结果显示这些突变是克隆性的。最近在其他类型的MDS中也出现了PNH克隆。但是这些PNH细胞比例比经典的PNH低很多，需要更灵敏的方法来检测和监测。罕见的PNH细胞也出现在了健康人中。

PNH的FCM的高敏检测：红细胞

?红细胞因为其含量丰富，GPI锚链蛋白表达也很丰富，适合稀有细胞检测的PNH检测，

?必须通过泛红细胞指标进行阳选，glycophorinA是唯一的红细胞特异的指标，所以只能用其和散射光来阳选红细胞，

?需要注意红细胞聚团的问题，GPI锚链蛋白和GlyA的抗体不能用饱和量，而且不同试剂单独使用和组合使用，最优抗体浓度可能不一样。

?推荐CDa-FITC，CD59-PE的组合，可以鉴定0.01%以下的III型PNH红细胞，加入CD55可以降低背景，提高II型PNH红细胞的灵敏度。

?如果有阴性对照，可以先测标本再测阴性对照，防止交叉污染。

PNH的FCM的高敏检测：白细胞

?单靠散射光、CD45是不足的，因为假的粒细胞会包含在内，可能会造成PNH克隆的假阳性。

?设门标记物：CD15bri标记粒细胞，CD33bri或CD64标记单核细胞，联合散射光和或CD45表达。

?报告标记物：有必要使用一个以上的GPI锚链蛋白鉴定小的PNH群，FLARE是特别重要的一个标记。比如粒细胞被单核细胞污染时，就会在圈出的中性粒细胞中出现CD24阴性的异常中性粒细胞，即假的PNH群，因此联合使用CD24和FLARE，鉴定其双阴性的细胞，会提高准确度。CD14用来报告单核的小PNH群也是不够的，因为单核的射门抗体会包含DC细胞，DC细胞不表达CD14，因此需要联合CD14和FLARE两个指标。

?研究正常群体的背景率，可以帮助测算灵敏度。

质量控制和熟练程度测试

?迄今还没有关于小PNH克隆的可重复性和精确度的外部的QA数据、实验室内或发表的实验室内研究。

?检测过程和报告解读越熟悉，结果越可靠

?正常样本的阴性对照和背景率评估对检测抗原缺失的实验特别重要，最好包含一个同等实验条件下%表达检测抗原的正常对照样本，不染色的对照可以用来确定阴性细胞群的位置，但是对于多数GPI锚链的标记物和FLARE，正常和缺失群体可以清楚分群。

?阳性对照：因为PNH是罕见病，每个样本都对应一个阳性对照对于很多实验室是不现实的，目前还没有令人满意的商业化的阳性对照。PNH细胞可以分装和栋存，红细胞更容易操作，因为红细胞可以稳定冻存在20-25%蔗糖/葡萄糖中。CollegeofAmericanPathologists和UKNationalExternalQualityAssessmentSchemes(UK-NEQAS)forLeucocyteImmunophenotyping有关于红细胞和白细胞的相关程序。鼓励高敏测试的实验室进行实验室内交换。

报告解读：经典PNH病人

白细胞：

1.PNH比例可以通过特异抗体组合圈出的粒细胞、中性粒细胞、单核细胞来报。

2.大多数病例中，髓系群体的GPI的缺失比例是一致的，个别也会遇到偏差，比如单核克隆稍微超过粒细胞克隆，但临床意义不明。

3.PNH标本中少量的正常细胞可以帮助判断抗体是否有效或用于指导圈门。

4.报告需要指出PNH克隆的比例，不是残留的正常细胞的抗原表达比例

红细胞：

1.熟悉正常样本和非染色样本的CD55、CD59的流式图谱，用于区分I型、II型、III型的分界线。

2.比对应的粒细胞、单核细胞的PNH克隆比例低，因为在循环中红细胞的寿命较短，病人有可能接受过输血或发生了血管内溶血。

3.红细胞染色没有提供有用信息，但比粒细胞更擅长于检测部分抗原缺失，虽没有特异的病人出现PNH临床症状的Cut-off值，20%的III型红细胞可能出现血管内溶血的临床症状。有大量II型红细胞但没有III型红细胞的病人比等量的III型红细胞的病人会出现网织红细胞增多症和LDH升高，但较少出现溶血。

4.需要报出PNH的红细胞群的百分比和II型、III型的比例，有些不能清楚进行II型、III型区分的需要在报告中强调。

5.监测红细胞PNH克隆可以用于评价依库珠单抗治疗的效果。（这个药抑制GPI锚缺失细胞的补体溶血，异常红细胞存活下来，比例可以增加到接近真实的异常造血克隆的大小）

报告解读：小PNH克隆的病人

1.再生障碍性贫血和MDS的病人中很容易检测到小克隆的PNH，其预后价值尚有异议

2.一些再障和RUCD的研究表明PNH克隆的出现有益于免疫抑制的治疗

3.有这些小克隆的病人需要被跟进，因为有发展成溶血PNH的风险，但是需要注意的是不适合用衣库珠单抗，因为小克隆的溶血非常少见

4.在溶血性贫血的病人中，检测到小的粒细胞克隆不应被诊断为经典溶血性PNH，而应查找其他引起溶血的原因。

其他影响解读的因素

?当MDS的病人排查PNH克隆时，外周血中少颗粒的粒细胞的出现会使圈门困难，因为其和单核细胞重叠，引入额外的非GPI锚链的标记可以清楚区分。

?陈血（48h)活细胞比例降低，FSC/SSC图形会变化，非特异染色会增加。

?不成熟的粒细胞有较弱的GPI锚链蛋白的表达，需要注意这个潜在陷阱。

?粒细胞减少和相对高比例的嗜酸性粒细胞的病人使用合适标记才能圈出纯的粒细胞门。

报告结果

?正常表达GPI锚链抗原的病人：

?粒细胞、单核细胞、红细胞正常表达GPI锚链抗原，没有检测到PNH克隆（避免使用PNH检测阴性或所有细胞都是阳性等容易引起困惑的报告）

?进一步的临床评论（取决于收到初始需求的临床信息的质量）

?简单陈述检测灵敏度

?如果有好的临床证据支持病人有再障或MDS，建议重复检测（对没有解释的有血栓、溶血、血红蛋白尿和无PNH克隆的病人不用重复检测）

?如果检测到异常，应迅速准确的和临场进行沟通

?每种系别的结果都需要报告，如果有II型细胞也需要报告，不用过度复杂的对每个抗体的量进行计算。

?如果只有小克隆被测到，最好说明“不等于诊断出了溶血性PNH”。在日常临床报告中，不要过度解释小克隆的重要性，尽管在科研中很重要。

?对于连续监测的报告，需要和之前的结果进行比较，以及可能的临床意义

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