血红蛋白的提取和分离基础知识通关
2017-9-15 来源：不详 浏览次数：次一、基础知识
（一）凝胶色谱法
1、凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。
2、凝胶实际上是一些微小的球体，这些小球体大多数是由构成的，如葡聚糖或琼脂糖。
3、在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程较短，移动速度。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
（二）缓冲溶液
1、缓冲溶液的作用是。
2、缓冲溶液通常由溶解于水中配制而成的。
3、生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的下进行的，为了能够在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的。
（三）电泳
1、电泳是指。
2、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子的差异以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。
3、两种常用的电泳方法是和，在凝胶中加入SDS，电泳速率完全取决于，因此，在测定蛋白质分子量时通常使用
二、实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步：
（一）样品处理
1、红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是，采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用离心（r/min），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层暗红色的红细胞倒入烧杯，再加入（质量分数为0.9%），缓慢搅拌10min，离心，如此重复洗涤三次，直至，表明红细胞已洗涤干净。
2、血红蛋白的释放：在和作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
3、分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心（r/min）后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明液体，这是，第4层是的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的。
（二）粗分离：透析
取1mL的血红蛋白溶液装入中，将它放入盛有mL的物质的量的浓度为20mmol/L的（pH7.0）中，透析12h。透析可以去除样品中的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
（三）纯化：凝胶色谱操作
1、制作凝胶色谱柱
2、装填凝胶色谱柱
①装填前将色谱柱垂直固定在支架上。因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积相差很大，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。
②装填时凝胶要缓慢倒入色谱柱内，装填时要轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀，色谱柱内不得有存在，一旦发现，必须重装。
③装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用mL物质的量浓度为20mmol/L的（pH7.0）充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。
3、样品的加入和洗脱
①准备：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的的缓冲液与凝胶面平齐，关闭出口。
②加样：用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。加样后打开下端出口，直到样品后，关闭下端出口。
③洗脱：小心加入物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。待接近色谱柱底端时，用试管收集。
（四）纯度鉴定：SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳
三、操作提示
1、红细胞的洗涤洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。
2、色谱柱填料的处理商品凝胶使干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需1—2h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。
3、凝胶色谱柱的装填在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
4、蛋白质的分离在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。
参考答案
一、(一)1.分配色谱法相对分子质量大小
2.多孔多糖类化合物较小较慢较大凝胶外部较快
（二）1.能够抵制外界酸或碱对溶液PH的影响，维持PH基本不变
2.1～2种缓冲剂
3.pH基本一致
（三）、1.带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
2.正电或负电相反带电性质大小、形状迁移速度
3.琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳分子大小SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
二、样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定
（一）1.去除杂蛋白低速短时间黄色血浆五倍体积的生理盐水低速短时间上清液中没有黄色
2.蒸馏水甲苯
3.甲苯层脂溶性物质的沉淀层血红蛋白的水溶液其他杂质红色透明液体
（二）透析袋磷酸缓冲液分子量较小
（三）2.②一次性气泡③磷酸缓冲液
3.②完全进入凝胶层③红色的蛋白质
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