糖化血红蛋白标准化和检测准确度现状

糖化血红蛋白标准化和检测准确度现状

上海市临床检验中心冯仁丰

摘要：糖化血红蛋白A1c（HbA1c）是诊断糖尿病和监测其治疗效果的重要指标。在国际临床化学与检验医学联合会（IFCC）定义了HbA1c的被测量之后，经过各方的努力，全球各临床实验室HbA1c检测结果间的差异正逐步减小。所有提供HbA1c检测产品的厂商都不会客观地描述自己产品的弱点，只会强调其优点和临床价值。面对HbA1c检测的现状，临床实验室必须充分了解每个产品的特性及其不足之处，在将产品用于临床检测前必须验证产品的分析性能。只有确认其分析性能能够用于临床检测时，才能使用。一个实验室内必须具备2种不同检测方法的产品，这样才能识别患者样品内有无异常血红蛋白。目前，尽管人们认为免疫学方法检测HbA1c时无异常血红蛋白的干扰，但国际上尚未从临床上对各种异常血红蛋白的影响作出客观的判断。为了患者的利益，临床实验室一定要充分了解更多的信息。

关键词：糖化血红蛋白；标准化；准确度

年，伊朗学者RANBAR等[1-2]从糖尿病患者红细胞中发现了异常血红蛋白。年，美国糖尿病协会（AmericanDiabetesAssociation，ADA）给他颁发了杰出发现奖[3]。然而，就在这一年，Ranbar博士去世了。如果当年不是Ranbar等在糖尿病患者中发现了糖化血红蛋白，如今的糖尿病研究究竟发展到哪一步还是个未知数。

一、明确糖化血红蛋白在糖尿病治疗和糖尿病并发症监测中具有重要价值[4]

（一）美国糖尿病控制与并发症研究（theDiabetesControlandComplicationsTrial，DCCT）20世纪80年代，糖尿病及其并发症对患者的不利影响受到了美国卫生和公共服务部（theUnitedStatesDepartmentofHealthandHumanServices，HHS）的高度重视。年，由美国HHS、美国卫生研究院（theNationalInstitutesofHealth，NIH）下属美国糖尿病、消化病、肾病研究院共同参与并开展了为期9年的DCCT试验。为了使DCCT得到明确的成果，研究者决定使用糖化血红蛋白作为观察病情控制或并发症的重要指标。面对当时市场上糖化血红蛋白检测试剂混乱的情况，DCCT的专家们要求在美国各地开展这项研究中所有涉及到的1型糖尿病患者的血液标本全部送往2个实验室（密苏里大学实验室和明尼苏达大学实验室）检测，并且指定密苏里大学实验室为唯一的比较实验室。该实验室检测糖化血红蛋白的方法为阳离子选择高效液相层析法，仪器由Bio-Rad公司生产；明尼苏达大学实验室也使用Bio-Rad公司相同型号的仪器，但必须按照密苏里大学实验室的样品结果予以校准。在当时既无参考物质又无参考方法的情况下，以人为指定的方式使检测结果具有可比性是有效的手段。以百分值报告糖化血红蛋白结果，确定糖化血红蛋白结果的参考区间上限为6.0%，糖化血红蛋白7.0%的患者必须接受治疗就是DCCT的研究成果[4]。如果要将DCCT的研究成果用于临床，为糖尿病患者服务，就必须使美国各临床实验室的糖化血红蛋白结果和DCCT的糖化血红蛋白结果具有可比性。如果仅确定各检测方法得出的糖化血红蛋白测定值是否在实验室的“正常范围”内是没有临床价值的。各临床实验室需要更精确地了解这个检测值与DCCT检测值的关系是什么？因为只有DCCT结果直接与平均血糖及临床后果的危险性相关。

（二）英国前瞻性糖尿病研究（U.K.ProspectiveDiabetesStudy，UKPDS）[5]

年，UKPDS发表了临床试验结果。他们对2型糖尿病患者进行了10年的研究，重复了DCCT的发现，即糖尿病患者并发症的减少与糖化血红蛋白降低有关。UKPDS使用了美国国家糖化血红蛋白标准化计划（theNationalGlycohemoglobinStandardizationProgram，NGSP）认可的糖化血红蛋白测定方法。另外，他们还通过与NGSP参考网络进行比对来确保DCCT和UKPDS检测结果的可比性。由此可见，DCCT和UKPDS的糖化血红蛋白结果都可以用于1型或2型糖尿病患者，预计未来还可用于预测糖尿病患者个人的并发症危险度。

二、什么是糖化血红蛋白（即什么是HbA1c的被测量）

糖化蛋白是食品行业评价烘烤的面包点心的一个重要指标。刚刚出炉的面包上闻到的香味以及在面包上看到的略带焦黄的颜色，这些都是面包中的糖分与蛋白在烘烤过程中蛋白被糖化后的表现。人体从食物中摄入淀粉和糖分，在胃肠道内被淀粉酶迅速分解为单个葡萄糖，由胃肠道吸收，然后进入肝脏，形成肝糖原储存于体内。因此，人体进食后血液中葡萄糖浓度会升高。此时，人体的内分泌激素，尤其是胰岛素会大量分泌，促使葡萄糖快速从血液中进入肝脏。如果我们不注意有规律地饮食，吃得过多，增加了摄入的葡萄糖量，使大量葡萄糖淤积于血液，导致血液中葡萄糖浓度明显升高，为了减轻血液内的负担，这些葡萄糖只能通过肾脏排出体外。长此以往，最终形成糖尿病。

由于血液中葡萄糖浓度升高，使血液中所有的蛋白质和代谢物均被高浓度葡萄糖包围。葡萄糖与蛋白质的紧密接触促使葡萄糖吸附在蛋白质上。在蛋白质结构的游离氨基处，先吸附葡萄糖，然后发生缓慢的分子重新排列，最终形成稳定的糖化蛋白。因此，血液中凡是具有游离氨基的蛋白质都会被糖化。但血液中许多蛋白质的存在时间或半衰期较短，所以被糖化的蛋白质的量不是很大。其中白蛋白的半衰期为1个月左右，检测糖化白蛋白可以大致反映患者近1个月内的血糖控制情况。

红细胞是血液中生存时间最长的一个有形成分，其半衰期可达3个月。血液中高浓度的葡萄糖不仅“糖化”了红细胞膜，还透过红细胞膜进入细胞浆内，“糖化”血红蛋白。在血红蛋白的每个珠蛋白长链上都有多个游离氨基，当血红蛋白与葡萄糖长期共存后会逐渐成为“糖化血红蛋白”。检测血液中红细胞内血红蛋白的糖化比例可以反映糖尿病患者约3个月内的血糖控制情况。

20世纪70年代，当研究者们了解了血红蛋白被糖化的情况后，第1个被用于临床实验室检测的项目是果糖胺。葡萄糖被蛋白游离氨基吸附并经分子重排后形成了血红蛋白分子上酮胺结构——1-脱氧果糖基。该基团具有氧化还原性质，可用于实验室检测。但由于无标准物质，所以不同方法间难以具有可比性。

早在年，研究者们就注意到成年人血红蛋白为非均相。年，Allen发现采用离子交换层析法分离人血红蛋白，其可被分离出3个小的组分，它们较血红蛋白A（hemoglobinA，HbA）的负电荷更强。这3个血红蛋白组分被命名为HbA1a、HbA1b、HbA1c。但是，Allen并没有认识到其与糖尿病的关系。直至Ranbar使用琼脂电泳发现这些小血红蛋白组分在糖尿病患者血液中明显升高，它们与糖尿病的关联才被人们所认识。20世纪70年代中期，科学家们发现是葡萄糖对HbA的非遗传修饰产生了HbA1c。HbA1c与空腹葡萄糖、葡萄糖耐量试验中的葡萄糖峰值及受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic，ROC）曲线下面积、以往数个星期的平均葡萄糖水平等均有关联。年，检测笼统的糖化血红蛋白的项目在临床上被广泛应用，但当时糖化血红蛋白结果的可比性很差。当前，人们已经清楚地认识到：天然（非糖化）的血红蛋白是HbA0（2α2β链），血红蛋白β链N-末端缬氨酸的游离氨基及其他游离氨基（α链N-末端缬氨酸、赖氨酸ε-氨基）可与不同的碳水化合物糖基化形成糖化亚组分（HbA1a1、HbA1a2、HbA1b和HbA1c）。所有这些糖化亚组分被称为总糖化血红蛋白（即HbA1）。少量的胎儿血红蛋白[fetalhemoglobin，HbF（2α2γ链）]和HbA2（2α2δ链）γ链或δ链N-末端缬氨酸以类似的方式被糖基化，形成HbA2c。因此，如今叙述的糖化血红蛋白其实指的是HbA1c。由于每个患者的血红蛋白浓度不同，所以，HbA1c量的表示方式以占总血红蛋白量的百分比更为合理。即HbA1c（%）=HbA1c/HbA×。

三、NGSP的HbA1c标准化

年，在DCCT结果公布前，美国临床化学协会（AmericanAssociationforClinicalChemistry，AACC）成立了HbA1c标准化委员会。该委员会的任务是实现美国各实验室HbA1c的可比性。AACC肯定了实现HbA1c检测国际可比性的重要性。由于欧洲各国在HbA1c的可比性和室间质评方面有着丰富的经验，因此HbA1c标准化委员会还包括了欧洲各国的成员。HbA1c标准化委员会围绕DCCT参考实验室建立了可比性方案。该方案在年被美国厂商的协调委员会认可。年，HbA1c标准化委员会解散，被美国NGSP替代（NGSP是由美国疾病控制中心负责的一个行政管理机构）。NGSP在年7月开始工作。年，NGSP被ADA认可。从年开始，控制糖尿病成为美国的政府行为。

（一）NGSP标准化的做法[6-7]

NGSP实现标准化过程有3个主要步骤，其样品均为新鲜全血。第1步是对厂商的测定方法进行校准，使厂商实验室的HbA1c结果和NGSP网络的实验室结果具有可比性；第2步是由厂商确认他们的产品也与NGSP网络的实验室结果具有可比性；第3步是各临床实验室参加室间质评，检测由NGSP网络实验室定值的新鲜全血样品，以验证他们日常报告的结果的可比性。严格来说，全世界的临床实验室只有得到NGSP的认可，才有资格报告以百分值表示的HbA1c结果。

（二）ADA的建议

实验室只使用被NGSP认可的HbA1c检测方法，其提供的HbA1c结果与DCCT结果具有可比性，可以使用由DCCT建立的参考区间。临床实验室自身也必须被NGSP认可，才有资格报告符合NGSP要求的结果（百分值）。在使用被NGSP认可的产品时，临床实验室检测NGSP新鲜全血样品的结果应符合检测性能要求，即方法应具有良好的重现性，其总不精密度须低于指定水平。

（三）NGSP和美国病理学家协会（theCollegeofAmericanPathologists，CAP）的协调[7]CAP提供了全世界最大的HbA1c能力比对试验。NGSP与CAP一起协调，通过NGSP为CAPGH2全血能力比对试验样品设定靶值，采纳和逐渐提升以准确度为基础的分级。年，CAP开始使用混合新鲜全血样品进行GH2调查。因为混合新鲜全血样品没有以往HbA1c调查品的基质效应，其结果可以可靠地用于检查方法内和方法间的偏移和不精密度。年，CAPGH2全血能力比对试验有超过家实验室参与，有许多实验室来自美国以外。

（四）检测方法性能上的改善

从年到年的10年间，所有方法检测HbA1c低浓度样品（4%～6%HbA1c）的变异系数（coefficientofvariation，CV）从7.0%下降到4.0%；对于6%～10%HbA1c的样品，所有方法的CV从5.0%～5.5%下降到4.0%。目前，许多方法的实验室间CV≤3.0%，少数方法已达到≤2.0%。CAP要求年后各实验室检测HbA1c的CV为7.0%。

（五）CAP的HbA1c分析目标临床医生在使用HbA1c评估糖尿病患者的血糖状态时经常需考虑患者的血糖控制是稳定、是改善还是控制不佳；还需考虑如何将HbA1c结果与糖尿病患者个人的目标HbA1c进行比较

（年，ADA建议糖尿病患者以6%HbA1c作为血糖控制目标，若可行则可再低一些）。临床医生可以0.40%HbA1c作为“临床上显著变化”的指标[患者必须接受强化治疗的HbA1c水平为7%，而CAP和NGSP确定的分析目标（即允许误差）为6%，相乘等于0.42%HbA1c，四舍五入为0.4%HbA1c]，如患者治疗后的HbA1c在7.0%±0.4%（即6.6%～7.4%）以内，说明HbA1c结果的变化主要是因检测误差所致，不是患者的病情有所改善。只有当HbA1c的检测结果6.6%时才可认为患者的治疗是有效的。年，在NGSP的调查中，低、中、高水平HbA1c的CV已分别达到3.8%、3.8%和3.4%。因此，CAP建议所有HbA1c检测方法的目标CV应保持在≤3.5%。

四、国际临床化学与检验医学联合会（theInternationalFederationofClinicalChemistryandLaboratoryMedicine，IFCC）的HbA1c标准化

（一）NGSP的标准化出现了问题[8]

被美国DCCT及NGSP中指定作为比较方法的Bio-Rex70树脂高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）与瑞典推荐的MonoSHPLC标准化方法在HbA1c判断限水平处的差异高达20%。日本的临床试验也显示，尽管采用HPLC检测HbA1c，但其HbA1c检测值低于美国NGSP的值。由此可见，DCCT参考方法测得的HbA1c值并不是真正的、唯一的HbA1c值。DCCT/NGSP的标准化只将密苏里大学实验室的HPLC分离结果作为标准化的唯一依据，没有任何HbA1c参考物质或确认该物质的参考方法。

（二）IFCC的糖化血红蛋白标准化[9]

年，IFCC成立了HbA1c标准化工作组，以建立HbA1c检测的国际统一标准。他们建立和确认了2个侯选参考方法，同时制备了HbA1c、HbA0（非糖化血红蛋白）参考物质，并以此作为全球可比性分析的基础。

1.确定HbA1c被测量首先，IFCC确定了HbA1c被测量。IFCC命名、属性和单位委员会（theCommitteeonNomenclature，PropertiesandUnits，C-NPU）批准了以往被称为“HbA1c”的参考测量程序（方法）。该程序测定的是单一分子属性，其检测结果为“物质组分的量（mol）”，而不是质量（重量）（kg）。在计量上可溯源至国际单位制（internationalsystemofunits，SI）。IFCCC-NPU认为：在所有有β链的血红蛋白中，β链N-纈氨酰-1-果糖基血红蛋白可被IFCC参考测量程序特异地测量，所以在计量单位上可溯源至“mmol/mol”。因此，IFCC的参考测量程序检测的被测量非常明确，检测的非糖化血红蛋白为β链血红蛋白（HbA0）；检测的糖化血红蛋白为β链N-纈氨酰-1-果糖基血红蛋白[HbA1c，即β-（N-脱氧果糖基）血红蛋白]。以往不规范的用语和测量（检测）单位：原IFCC-国际理论和应用化学联合会（theInternationalUnionofPureandAppliedChemistry，IUPAC）的命名、属性和单位（nomenclature，propertiesandunits，NPU）数据库有“HbA1c”专用的属性类词语，该被测量的代码为NPU，命名的是血红蛋白（Fe；全血）和血红蛋白A1c（Fe），为物质的组分；其计量单位被假设为“1”。

2.IFCC的HbA1c参考测量系统　　年，IFCC批准了检测人全血HbA1c的2个参考方法[高效液相色谱-电喷雾质谱（highperformanceliquidchromatography-electrosprayionization/massspectrometry，HPLC-ESI/MS）与高效液相色谱-毛细管电泳（highperformanceliquidchromatography-capillaryelectrophoresis，HPLC-CE）][10-11]。这2种参考方法依据对血红蛋白β链N端的特定检测[12]，能得到一致的结果。其基本原理是以胞内蛋白内切酶Glu-C水解完整的血红蛋白分子，得到HbA1c和HbA0的β链N端的六肽多肽。这些多肽以反相HPLC分离，并由电喷射离子化-质谱或由毛细管电泳进行定量。以水解得到多肽和联用分离技术克服了以往使用的HbA1c分离系统分辨率不足的缺点。年，欧洲参考物质和参考测量研究院（theInstituteforReferenceMaterialsandMeasurements，IRMM）批准并发布了IRMM/IFCC-号参考物质[13]。该参考物质为人全血分离的血红蛋白，内含非糖化的HbA0和糖化的HbA1c。该参考物质给出了HbA1c/（HbA0+HbA1c）值（mmol/mol）。在IFCC参考实验室和现有的指定比较方法（designated







































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