生物化学蛋白质化学

01

蛋白质中常见氨基酸结构特征、分类方法，三字母符号和单字母符号；不常见氨基酸和非蛋白质氨基酸的典型例子及作用

蛋白质的水解产物是氨基酸，有酸水解、碱水解及酶解。

酸水解：6MHCl，4MH2SO4回流20h，不引起消旋（旋光异构体的变化），色氨酸破坏，羟基氨基酸（丝氨酸与苏氨酸）部分水解；天冬酰胺与谷氨酰胺酰胺基水解。

碱水解：引起消旋，色氨酸不破坏，精氨酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。

酶水解：水解不完全，无破坏。

氨基酸的名称（全称，三字母，单字母，结构）

非极性、脂肪族aliphaticR基团

甘氨酸

（不含手性碳）

glycine

Gly（G）

丙氨酸

alanine

Ala（A）

缬氨酸

valine

Val（V）

亮氨酸

leucine

Leu（L）

异亮氨酸

isoleucine

Ile（I）

甲硫氨酸（含硫氨基酸，代谢中甲基供体）

methionine

Met（M）

极性不带电荷的氨基酸

丝氨酸

Serine

Ser（S）

苏氨酸

Theronine

Thr（T）

半胱氨酸

胞内，以氧化型胱氨酸存在，-SH形成二硫桥

cystcine

Cys（C）

脯氨酸

杂环

Proline

Pro（P）

天冬酰胺

Asparagine

Asn（N）

谷氨酰胺

Glutamine

Gln（Q）

两个酰胺在生理pH范围内酰胺基不被质子化，侧链不带电荷。

芳香族aromaticR基

苯丙氨酸

用于苯丙酮尿症检验

phenylalanine

Phe（F）

酪氨酸

tyrosine

Tyr（Y）

色氨酸

体内转化为尼克酸（维生素PP）

tryptophan

Trp（W）

带正电荷（pH=7）

赖氨酸

Lysine

Lys（K）

精氨酸

尿素形成过程中中产物

arginine

Arg（R）

组氨酸

Histidine

His（H）

带负电荷（pH=7）

天冬氨酸

asparticacid

Asp（D）

谷氨酸

glutamicacid

Glu（E）

不常见氨基酸和非蛋白质氨基酸的典型例子及作用

5-羟赖氨酸，4-羟脯氨酸存在于结缔组织胶原蛋白中。

γ-羧基谷氨酸在凝血酶原中发现，存在于与血液凝固相关蛋白中。

焦谷氨酸在细菌紫膜质中找到，光驱动质子泵蛋白质。

细菌细胞壁的肽聚糖中D-谷氨酸，D-丙氨酸

γ-氨基丁酸由谷氨酸脱羧产生，传递神经冲动的化学介质，神经递质。

D-环丝氨酸，链霉菌属产生抗生素，抑制细菌细胞壁形成，用作抗结核菌药物。

02

氨基酸的酸碱化学，计算氨基酸等电点，利用Handerson-Hasselbalc公式计算氨基酸溶液中各种离子比例与浓度，用甲醛滴定法测定氨基酸含量。

氨基酸在溶液和晶体状态均以兼性离子形式存在。

氨基酸晶体由离子晶格组成，维持晶格中质点作用是强大的异性电荷间静电作用。极性分子的介电常数高，偶极离子形式的氨基酸是强极性分子，故氨基酸能使水的介电常数增高。

Handerson-Hasselbalc公式：

pH=pKa+log[质子受体]/[质子供体]

结合pKa1,pKa2,计算在任一pH下氨基酸的离子比例。

除组氨酸外，基本氨基酸在生理（pH=7）无明显缓冲容量，组氨酸咪唑基pKa=6，在pH7附近有明显缓冲，红细胞运载氧气的血红蛋白含有较多组氨酸，使其在血液中有显著缓冲作用，这对红细胞运输氧气和二氧化碳很重要。

氨基酸等电点

pI=(pKa1+pKa2)/2

Lys赖氨酸、精氨酸Arg，组氨酸His（带正电极性氨基酸）pI是两个大的pK和一半；AspGluTyr酪氨酸Cys半胱氨酸pI是两个小pK平均值。

pH＞pI，氨基酸带净负电荷，在电场上向正极移动；

pH＜pI，氨基酸带正电荷，向电场负极移动。

氨基酸的甲醛滴定

氨基酸等电点过高或过低，氨基酸溶液中存在1M甲醛时，滴定终点由12变至9（酚酞变色区域），甲醛与氨基酸中氨基形成羟甲基衍生物，降低氨基碱性，增强氨基酸性解离。

03

氨基酸α-氨基参加的各种反应与用途；

α-羧基的各种反应与用途；

α-氨基/羧基共同参与反应及其用途；

R基参加的一些重要反应及其用途。

α-氨基反应

与亚硝酸反应

标准条件下生成氮气体积，氨基酸定量与蛋白水解程度测定，生成的氮气只有一半来自于氨基酸

与酰化试剂反应

多肽和蛋白质的人工合成中蛋白质的保护试剂；丹磺酰氯是多肽链N端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。

烃基化反应

DNFB在弱碱性溶液中发生亲核芳环取代，生成二硝基苯基氨基酸，Sanger法鉴定多肽蛋白N末端氨基酸；

PITC异苯硫氰酸酯在弱碱性形成苯胺基硫甲酰PTC衍生物，Edman鉴定多肽或蛋白质N端氨基酸。

席夫碱

_

脱氨基反应

经氨基酸氧化酶催化形成酮酸

α-羧基反应

成盐/成酯

标准条件下生成氮气体积，氨基酸定量与蛋白水解程度测定，生成的氮气只有一半来自于氨基酸

成酰氯

使氨基酸羧基活化，使其与另一氨基酸氨基结合，常用于多肽人工合成。

脱羧基

_

叠氮反应

氨基酸叠氮反应常用于肽的人工合成。

α-氨基/羧基共同参与反应及其用途

茚三酮反应

茚三酮在弱碱溶液中与α-氨基酸共热，形成紫色物质，用柱层析或纸层析将各种氨基酸分离，利用茚三酮显色可定性鉴定并用分光光度计在nm，定量测量各种氨基酸。

脯氨酸与羟脯氨酸与茚三酮反应后，不释放氨气，直接生成亮黄色化合物。

成酰氯

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R基参加的一些重要反应及其用途

Pauly反应：检测酪氨酸，酪氨酸的酚羟基与重氮化合物结合生成橘黄色化合物。

精氨酸侧链胍基在硼酸钠溶液中，与1,2-环己二酮反应，形成缩合物，缩合物可在羟胺溶液中还原为精氨酸，用于氨基酸序列分析及结构与功能研究。

分光光度计测定蛋白质中色氨酸含量：色氨酸吲哚基团在温和条件下被N-溴代琥珀酰亚胺氧化。

半胱氨酸形成稳定烷基衍生物，有助于测定氨基酸序列，保护肽链上的-SH链，以防止被重新氧化为二硫键。

巯基可与金属离子形成稳定程度不等的络合物，蛋白质结晶学中制备重原子衍生物最常用方法之一。当酶的活性中心涉及-SH基，与重原子生成硫醇盐，导致酶的失活。

分光光度计测定-SH基：半光氨酸可与二硫硝基苯甲酸DTNB或Ellman试剂发生反应，1分子半胱氨酸引起1分子硫硝基苯甲酸释放，pH8.nm强烈光吸收。

巯基易受金属离子催化，加速氧化。

过甲酸可定量打开胱氨酸的二硫键，生成磺基苯氨酸残基。

04

氨基酸的立体化学与旋光性

芳香族氨基酸的最大吸收峰

核磁共振在氨基酸结构研究中的作用

胱氨酸异构体是内消旋胱氨酸。

紫外吸收光谱

芳香族氨基酸一般最大吸收在nm波长处，利用分光光度方法可以测定蛋白质含量。不同蛋白质氨基酸含量不同，摩尔吸收系数不同。

色氨酸显现磷光。

核磁共振NMR（nuclearmagneticresonance）

氨基酸质子的化学位移决定于特定化学环境，决定于氨基酸的电离状态；滴定时电子密度的变化将迅速传递到脂肪族氨基酸的整个碳链和芳香族氨基酸的脂肪链；相邻碳上质子间偶合常数取决于电离状态。

05

氨基酸混合物的分析分离

纸层析

离子交换层析

高效液相色谱（HPLC）

分配层析法一般原理：

分配系数：当一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中浓度比值。

逆流分溶仪一般用于制备分离、纯化蛋白质、肽、核酸和抗生素等。

纸层析：滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用溶剂是流动相。用茚三酮显色，得到双向纸层析谱。

薄层层析

离子交换层析：离子交换树脂作支持剂，阳离子交换树脂酸性基团可解离H+，环境中的氨基酸阳离子可与H+发生交换而结合在树脂上，同样，阴离子交换树脂可结合氨基酸阴离子。分离氨基酸混合物常用强酸性阳离子交换树脂。树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液（pH2-3）上柱。氨基酸在树脂上结合牢固程度，决定于静电吸引，其次是氨基酸侧链和树脂基质聚苯乙烯间疏水相互作用。pH3时，静电吸引力次序碱性氨基酸＞中性氨基酸＞酸性氨基酸，故洗脱顺序为逆序，逐步提高洗脱剂的pH值和盐浓度。

气液层析：利用样品组分在流动的气相和固定在颗粒表面的液相中分配系数不同。

高效液相色谱：使用固体相支持剂，故表面很大；溶剂系统采用高压，洗脱速度快。

06

蛋白质分类常用方法，蛋白质的生理功能

蛋白质元素组成CHON（16%）S，凯氏定氮法

简单蛋白（完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分）

根据物理性质（溶解性），分为：

清蛋白：溶于水

球蛋白：稀盐溶液

谷蛋白：稀酸或稀碱

醇溶蛋白：70%乙醇

组蛋白：溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀

精蛋白：溶于水或稀酸，不溶于氨水

硬蛋白：只溶于强酸

结合蛋白

根据辅基分为：核蛋白，脂蛋白，糖蛋白，磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。

按蛋白质的生物学功能分类：

催化：酶

结构：锚定蛋白与连接蛋白。

运输：血红蛋白，血清蛋白，载脂蛋白、膜转运蛋白

贮存

运动:肌球蛋白与肌动蛋白

防御：凝血与纤溶系统蛋白因子、溶菌酶、干扰素

调节：激素与反式作用因子

感觉

遗传调控

按蛋白质的形状与溶解度：

纤维状蛋白质：比较简单、有规则的线性结构

球状蛋白质：多肽链折叠紧密，疏水氨基酸侧链位于分子内部，亲水侧链在外部暴露于水溶剂。

膜蛋白质：与细胞的各种膜系统结合而存在，为能与膜内的非极性相相互作用，膜蛋白的疏水氨基酸侧链伸向外部，故膜蛋白不溶于水，但溶于去污剂。

对于不含辅基的简单蛋白质，用除相对分子质量，可估算氨基酸残基数目。蛋白质20种氨基酸平均相对分子质量-H2O18=

07

肽键结构和肽类有关概念

肽类的物理和化学性质

计算短肽链等电点和净电荷量

肽和肽键

肽键CN均为sp2杂化，有部分双键的性质，相关6个原子处于共平面（肽平面），肽平面两个Cα处于反式构象。

酰胺平面：由于肽键是一个共振杂化体，肽键具部分双键性质，不能自由旋转，肽键上面的6个原子共平面。

含2个及以上肽键的化合物如双缩脲能与硫酸铜-氢氧化钠溶液产生双缩脲颜色反应。

肽键共振的重要结果：

限制绕肽键的自由旋转，给肽主链的每一氨基酸残基只保留2个自由度；组成肽基的6个原子共平面；肽键的能障在室温下足以防止旋转，保持酰胺基处于平面。

肽类的物理和化学性质：

当溶液pH＞解离侧链pKa，占优势离子形式是侧链的共轭碱；pH＜解离侧链pKa，优势离子形式是共轭酸。

肽的等电点计算需先分别判断各解离基团的带电荷，统计净电荷量。

肽的化学反应与氨基酸类似，由于有肽键存在，肽可以进行双缩脲反应。

蛋白质部分水解后得到肽，只要水解过程中不对称原子不发生消旋，具有旋光性。一般短肽旋光度=肽中各氨基酸旋光度总和。

天然存在活性肽：肽类激素、肽类抗体、肽类毒素

eg.Met-脑啡肽Leu-脑啡肽催产素

08

多肽链氨基酸序列测定方法

N-/C-末端分析方法

二硫桥断裂

氨基酸组成分析方法

肽段氨基酸序列测定方法

肽段拼接

（1）蛋白质测序策略（片段重叠法）

确定蛋白质纯度在97%以上，知相对分子质量（误差＜10%）

测定多肽链数目。检测到的末端基多于一种，蛋白质由两条或多条不同的多肽链组成，样品是杂多聚蛋白质。

拆分多肽链，断裂S-S键。

分析每一条多肽链的氨基酸组成。

鉴定多肽链N-末端C-末端氨基酸残基

用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段

测定各肽段成完整的多肽链，重建完整多肽链的一级结构。

确定二硫键的位置

（2）N-/C-末端分析方法

N-末端测定

二硝基氟苯法(DNFB-Sanger)：2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-aa。该产物能够用乙醚抽提分离。不同DNP-aa可用纸层析、薄层层析或HPLC色谱法进行鉴定。

丹磺酰氯DNS可以与N-aa游离氨基作用，得到丹磺酰-aa（有很强荧光吸收，检测灵敏度可达到1*10-9mol），比DNFB灵敏倍。

异硫氰酸苯酯（PITC法）：N-末端氨基酸生成相应PTH（苯乙内酰硫脲）-aa，脱离肽链，可连续测定N-末端氨基酸，广泛应用于肽链的氨基酸序列测定。

氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，能从多肽链N-端逐个水解，释放氨基酸。根据不同反应时间测出酶水解释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，确定蛋白质N-残基。

C-末端测定

还原法：C-末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的α-氨基醇，肽链水解后，再用层析法鉴定。

Sanger早期用此方法测定胰岛素AB链。

肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，可断裂所有肽键，除C端氨基酸外，其他氨基酸都可转变为相应酰肼化合物。肼化物能够与苯甲酸缩合为不溶于水物质，与C-aa分离，C-aa可用纸层析鉴定，但精氨酸→鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。

羧肽酶法：pH8.℃与羧肽酶保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，依据量与时间关系，推断C-aa排列顺序。常用有A（来自胰脏）、B（来自胰脏）、C（柑橘叶）、Y（面包酵母）。A能水解除ProArgLys以外所有C-aa；B只能水解以ArgLys为C-aa端肽键，常将AB混合使用，Y可以用于任何氨基酸。

（3）二硫桥断裂与二硫键位置确定方法

过甲酸氧化法

巯基还原法

过量巯基乙醇处理（pH8-9，室温下放置数小时），8M尿素或6M盐酸胍存在，使蛋白质变性，多肽链松散而成无规则构象，还原剂才能作用于原来分子内部的二硫键。

二硫键位置确定方法

对角线电泳法：pH6.5第一向电泳，肽段按含大小与电荷不同分离；过甲酸熏蒸断裂二硫键，二向电泳，偏离对角线处是巯基。

（4）氨基酸组成分析

一般用酸水解，得到氨基酸混合物，分离测定氨基酸，目前用氨基酸自动分析仪，2-4h可完成。

酸水解中，色氨酸破坏，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺中酰胺键被水解。

碱水解许多氨基酸被破坏，色氨酸保留。

蛋白质的氨基酸组成一般用每摩尔蛋白质中含氨基酸残基的摩尔数表示。

（5）多肽链的部分裂解与肽段混合物的分离纯化

酶法裂解：

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作用位点

R1

R2

胰蛋白酶

碱性氨基酸羧基参与形成肽键

LysArg（专一性，水解速度快）Cys（能水解，速度慢）

Pro会抑制水解

糜蛋白酶

芳香族氨基酸羧基形成肽键

PheTrpTyr（水解速度快）

LeuMetHis（水解速度慢）

Pro会抑制水解

嗜热菌蛋白酶

疏水氨基酸氨基端形成肽键

Pro会抑制水解

LeuIlePheTrpValTyrMet（疏水性强残基，水解速度快）

GlyPro不水解

胃蛋白酶

两端均为疏水性氨基酸，酸性条件

Pro会抑制水解

PheLeuTrpTyr及其他疏水氨基酸水解快

化学法裂解：

溴化氰CNBr断裂甲硫氨酸羧基参与形成肽键，反应在70%甲酸中进行。

羟胺断裂法：断裂Asn-Gly间的肽键，但专一性不强。

用上述方法断裂的多肽混合物常用凝胶过滤、凝胶电泳和高效液相色谱等方法分离纯化。

（6）肽段氨基酸序列测定方法

Edman化学降解法

酶降解法

质谱法：MS测序要求样品是挥发性的，蛋白质、核酸、糖类等生物大分子挥发度很低，加热易分解，有快速原子轰击法（FAB）和电喷射电离（electrosprayionization，ESI）。

电喷射电离基本步骤：蛋白质溶液在高电场中通过毛细管静电分散成携带高电荷的微滴；蛋白质离子从微滴中被解吸进入气相；蛋白质离子进入质谱仪分析。

根据核苷酸推定：用待测蛋白质作抗原免疫动物，得相应抗体，用此抗体去沉淀合成该蛋白质的多核糖体，因为在这种多核糖体上含有该蛋白质的模板mRNA和与其相连而未被释放的蛋白质多肽链。将人的抗体发生结合而使多核糖体沉淀；从沉淀中分离mRNA，将其转录为cDNA。测出cDNA的核苷酸序列，推测出蛋白质的氨基酸序列。

09

同源蛋白质物质差异与生物进化

同源蛋白质有序列同源性，有保守区与非保守区，利用同源蛋白质非保守区域氨基酸残基的变化可以分析物种的进化位置，绘制进化树。

蛋白质家族形成可能有趋同进化和趋异进化两种机制。

序列相同，功能相似，序列变化，可以导致功能的较大变化。

蛋白质氨基酸序列的局部断裂可以产生相应的生物活性。

血液凝固涉及氨基酸序列断裂的一系列酶原被激活。

级联放大作用（cascadeamplification）：在整个反应过程中，各级信号逐级放大的作用称为级联放大作用。如某些激素如肾上腺素以10-8-10-5M浓度达到靶细胞，几秒钟可以使糖原磷酸化酶活性达最大值。激素与膜细胞表面激素受体结合，激活腺苷酸环化酶迅速合成cAMP，随机触发一系列酶促反应，信号放大。

凝血酶：去掉血纤蛋白上部分小肽段，使得血纤蛋白间的静电斥力降低，从而促进聚集。

纤溶酶：专一断裂血纤蛋白棒状连接区中肽键。

10

肽链人工合成的基本方法

肽的人工合成：（1）由不同氨基酸按照一定顺序的控制合成，（2）由一种或两种氨基酸聚合或共聚合。

接肽前将其他基团加以保护、封闭，避免与接肽试剂发生作用而生成不需要的肽键或其他键。

氨基保护基：苄氧甲酰基

羧基保护：盐或酯

正常情况下，羧基和氨基间形成肽键是不会自发形成的，需要对其中一个基团活化。

羧基活化常用叠氮法、活化酯法、混合酸酐法等。

氨基活化常在接肽时加入有机碱，如三乙胺保证氨基处在自由状态。

年，我国完成了牛胰岛素的全合成。

固相肽合成可以有效提高合成效率，降低合成成本。

固相合成中，肽链的逐步延长是在不溶性聚苯乙烯树脂小珠上进行，为反应后可通过简单的过滤回收被延长的产物，用于下一步合成。

11

研究蛋白质空间结构的常用方法

1.X射线衍射法

光源是波长很短的X射线，经物体散射后的衍射波，达到衍射图案（diffractionpattern），需用数学方法代替透镜进行收集重组，绘制出电子密度图（electrondensitymap），构建出三维分子图像（分子结构模型）。

想获得蛋白质的三维图像，必须从所有可能角度对蛋白质进行观测。当X射线与蛋白质相互作用时，只有一小部分射线被散射，大部分穿过蛋白质，相当一部分破坏性与蛋白质相互作用，在尚无足够的X射线被散射以形成有用的图像前，蛋白质分子已被破坏。

2.紫外差光谱

芳香族、杂环族的共轭环系统是发色团。发色团的吸光性质与微环境相关，包括溶液、pH、溶剂及邻近基团的极性性质。当发色团（Trp/Tyr/Phe）暴露在蛋白质分子表面时，pH和溶剂性质起主要影响；埋于分子内部，则以邻近基团影响为主。

差光谱：微环境变化前后两光谱之差，是两种不同条件下的比较，选用变性（多肽链伸展地）蛋白质或天然蛋白质作为参比；可推断蛋白质在特定条件下的溶液大致构象。

环境极性增大，吸收峰向短波长移动，称为蓝移/向紫效应（hypsochromiceffect）；吸收峰向长波长方向移动，称红移/向红效应（bathochromiceffect）。

测定紫外差光谱是在双光束紫外分光光度计上进行。

3.荧光和荧光偏振

荧光（fluorescence）：极少数分子吸收的激发能只转移一小部分，大部分将再辐射。以荧光再辐射的总能量小于原吸收的总能量，荧光波长比激发波长长。

荧光光谱技术可以探索Trp和Tyr的微环境以及蛋白质分子构象变化。

荧光偏振（fluorescencepolarization）与荧光探针结合常用于测定蛋白质的疏水微区，研究酶与底物、辅因子或抑制剂结合过程中蛋白质构象的变化，以及多亚基蛋白质的缔和和解离。

4.圆二色相

圆二色性：手性物质对EL和ER的两种光的吸收（振幅减小）不同，使左、右圆偏振光叠合成椭圆偏振光。

蛋白质的远红外CD光谱反映主链构象。

圆二色性还能用于估算蛋白质中α螺旋、β折叠、无规卷曲的含量。

5.核磁共振（NMR）

重氢交换可以测定蛋白质中α螺旋含量，拉曼光谱（RamanSpectroscopy）用于研究主链构象，光散射可获得生物大分子重要信息。

12

蛋白质的结构层次

一级结构：多肽链的氨基酸序列。

二级结构：多肽链借助氢键形成的有规则的局部结构，不涉及氨基酸残基侧链构象。氢键是维系二级结构最主要的键。

三级结构：多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。球状构象给出最低的比表面积，使蛋白质与周围环境的相互作用降到最低。

四级结构：寡聚蛋白质中各亚基间空间上的相互关系和结合方式。

1.维持蛋白质三维结构作用力：

氢键（方向性，饱和性）

多肽主链上的羰基氧和酰胺氢间形成的氢键，稳定蛋白质二级结构的主要作用力。

氢键的两个重要特征：

（1）方向性：相互吸引的方向沿氢受体y的孤电子对轨道轴，受体与供体间角度近°

（2）饱和性：x-H只能与1个y原子相结合。

大多数蛋白质折叠策略，使主链肽基间形成最大数目的分子内氢键，同时保持大多数能成氢键的侧链处于蛋白质分子的表面将与水相互作用。

范德华力（定向效应、诱导效应、分散效应）

定向效应：极性分子间，永久偶极间的静电相互作用。

诱导效应：极性物质与非极性物质间。

分散效应：非极性物质间。

疏水作用（熵效应）

疏水作用：水介质中球状蛋白质的折叠总倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部。

蛋白质溶液系统的熵增加是疏水作用的主要动力。

当疏水化合物或基团进入水中，周围的水分子将排列成刚性的有序结构，笼形结构（clathratestructure）。

疏水作用在生理温度范围内随温度升高而增强；超过一定温度后，又减弱。

非极性溶剂、去污剂是破坏疏水作用的试剂，是变性剂；盐酸胍和尿素破坏氢键、破坏疏水作用，是强变性剂。

盐键

盐键：正电荷与负电荷间的静电相互作用。

在生理pH下，蛋白质中酸性氨基酸（AspGlu）的侧链可解离成负离子，碱性氨基酸（LysArgHis）侧链可解离成正离子。基团分布在球状蛋白表面，与介质水分子发生电荷-偶极间相互作用，形成有序排列的水化层。

在疏水环境中，介电常数比水中低，相反电荷间吸引力相应增大。

二硫键

大多数情况下，二硫键是在多肽链的β转角附近形成的。

2.蛋白质的构型与构象

构型：在具有相同结构式的立体异构式中取代基团在空间的相对取向，构型变化需要共价键变化。

构象：具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能的多种形态。

3.酰胺平面及相关概念，拉氏构象图

酰胺平面：肽键具有部分双键性质，不能绕键自主旋转；主链肽基成为刚性平面，称为酰胺平面，平面内C=O与N-H呈反式排列，各原子间有固定的键角和键长。

多肽链主链的各种可能构象是用Ψφ这两个二面角或扭角来描述。

二面角（φ，Ψ）所规定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非共价键合原子间的接近有无阻碍。

拉式构象图（Ramachandranplot）：根据原子非范德华半径确定非共价键合原子间的最小接触距离，确定哪些成对二面角所规定的两个相邻肽单位的构象是是否允许的。

非键合原子间距离≥最小接触距离，两者无斥力，构象能量最低，构象是稳定的。

4.蛋白质二级结构含义，螺旋、折叠片、转角、凸起、无规则弯曲等二级结构元件的结构特点；

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定义与性质

影响因素

α-螺旋

多肽链中各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升距离即螺距为0.54nm，3.6个氨基酸残基，两个氨基酸间距离为0.15nm

肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每一个氨基酸残基的酰胺基团的-NH基与其后第四个氨基酸残基酰胺基团-CO基形成氢键。

蛋白质分子为右手α-螺旋。

R基太小使键角自由度过大，带同种电荷的R基相互靠近，β碳原子上有分支均不利于形成α螺旋。

含脯氨酸肽段不能形成α螺旋

β折叠片

由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排练，通过链间的氢键交联形成。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。两个氨基酸间轴心距为0.35nm；β-折叠结构可以由两条肽链间形成，可以在同一肽链的不同部分间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键交联，氢键与链的长轴接近垂直。

有两种：平行式：所有肽链的N端都在同一边；反平行式：相邻两条肽链的方向相反。

β-转角

由四个氨基酸残基组成，弯曲处第一个氨基酸残基C=O和第四个残基-N-H间形成氢键，形成一个不稳定的环状结构。多位于分子表面，促进肽链回折

β-凸起

β折叠中额外插入一个氨基酸残基，使得两个正常氢键间一侧是两个氨基酸残基，一侧是一个氨基酸残基。

无规卷曲

此类有序的非重复性结构经常构成酶活性部位和其他蛋白质特异的功能部位

纤维状蛋白：主要起支持和保护作用，纤维状或棒状。包括有角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白，肌球蛋白、血纤蛋白原，不包括微管、肌动蛋白细丝和鞭毛。

角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白质。

α-角蛋白：由α-螺旋构象的多肽链构成。α角蛋白伸缩性很好，一根毛发纤维湿热时可拉长到原有长度的二倍，α螺旋被撑开，各圈间氢键被破坏，转变为β构象。张力去除后，单靠氢键不能使纤维恢复，相邻螺旋靠二硫键交联（α-蛋白中二硫键数目越大，纤维刚性越强，α-角蛋白伸缩性能很好）。

永久性烫发/染发:α-角蛋白在湿热条件下伸展转变为β构象，冷却干燥时自发恢复。先用还原剂打开链间二硫键；除去还原剂，涂上氧化剂以便在相邻多肽链的半胱氨酸残基对间建立新二硫键。洗涤冷却头发，头发以新二硫键形成使头发纤维的α螺旋发生扭曲。

β-折叠片蛋白质：丝心蛋白，以反平行β折叠片堆积成多层，链间以氢键连接，层间靠范德华力维系。丝纤维有很高的抗张强度。由于堆积层间由非键合的范德华力维系，丝很柔软；由于丝心蛋白肽链处于相当伸展状态，故不能拉伸。

胶原蛋白：由三条肽链组成的三股螺旋（右手超螺旋结构）构成二级结构。螺旋为8.6nm，其中每一股螺旋又是一种特殊的左手螺旋，螺距为0.95nm，每一螺旋含3.3个残基，每一残基沿轴向的距离是0.29nm。一级结构分析表明，α-肽链的96%都是按三联体的重复顺序：（gly-x-y）n排列而成。Gly数目占残基总数的1/3，x常为Pro，y常为Hpro（羟脯氨酸）和Hlys（羟赖氨酸）。胶原蛋白属于结构蛋白，使骨、腱、软骨和皮肤具有机械强度。

胶原蛋白含有不常见氨基酸（4-羟脯氨酸，3-羟脯氨酸，5-羟赖氨酸），需经脯氨酰羟化酶、赖氨酰羟化酶催化，酶催化需分子氧、抗坏血酸、α酮戊二酸参与，Fe(II)是酶的辅因子，人缺乏维生素C难以合成。

胶原纤维分子内交联提高胶原蛋白的机械强度，随年龄增长，在原胶原三股螺旋内和间形成的共价交联键越来越多，使结缔组织中胶原纤维越硬而脆，改变肌腱。韧带和软骨的机械性能，眼球角膜透明度减小。

弹性蛋白

肌球蛋白与原肌球蛋白

5.超二级结构与结构域概念和主要结构类型

超二级结构super-secondarystructure：蛋白质二级结构和三级结构间的一个过渡性结构层次，在肽链折叠过程中，因一些二级结构的构象单元彼此相互作用组合而成。典型的超二级结构有罗斯曼折叠模式βαβ、4股α螺旋形成的四螺旋束。

结构域domain：生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，在二级结构、超二级结构基础上形成的三级结构局部折叠区，相对独立的紧密结构实体，称为结构域。同一种蛋白质中不同结构域间常可通过不具二级结构的短序列连接起来。蛋白质分子中不同的结构域常由基因的不同外显子所编码。

6.球状蛋白三级结构特征，膜蛋白结构特征

球状蛋白质三维结构的特征：

1.含多种二级结构元件

2.具有明显折叠层次

3.球蛋白分子是紧密近似球状的实体

4.疏水侧链在分子内部，亲水侧链在分子表面

5.分子表面有空穴，是结合底物、效应物等配体，行使生物学功能的活性部位，空穴通常是一个疏水区域。

膜内在蛋白：分为通过小的疏水肽链锚定于膜，蛋白质大部分位于膜的一侧或两侧伸展于水环境中；大部分蛋白埋在膜中，很小表面在膜外暴露于溶剂水中。有（1）具有单个跨膜肽段的膜蛋白（eg血型糖蛋白，人白细胞结合蛋白，病毒刺突蛋白），（2）具有7个跨膜肽段的膜蛋白（ATP酶，乳糖通道蛋白），（3）β桶型膜蛋白-膜孔蛋白。内在蛋白又称为整合蛋白，以不同程度嵌入脂双层内部，有的为全跨膜蛋白（transmembraneproteins），膜蛋白是两亲分子，与膜结合非常紧密，只有用去垢剂（detergent）才能从膜上洗涤下来，常用SDS和TritonX-。

膜锚定蛋白：蛋白质与膜的缔和是通过共价键连接的脂锚钩实现的。

脂锚定蛋白通过磷脂或脂肪酸锚定、共价结合。分两类：（1）糖磷脂酰肌醇（GPI）连接蛋白，GPI位于细胞膜的外小叶，用磷脂酶C处理能释放出结合的蛋白质。许多细胞表面的受体，酶、细胞粘附分子和引起羊骚养病的PrPC是此类蛋白；（2）脂锚定蛋白与插入质膜内小叶的长碳氢链结合。

脂锚钩能可逆的与蛋白质连接或脱离，为改变蛋白质对膜亲和性提供转换装置，是真核细胞中控制信号传导途径的因素。

7.蛋白质复性与变性的概念与蛋白质折叠的规律，预测蛋白质空间结构的基本方法。

蛋白质的变性

特点：空间结构破坏，一级结构完好；活性丧失；溶解度降低；易分解，侧链基团暴露。

变性：加热、辐射、高压等物理因素；有机溶剂、酸、碱、尿素等化学因素。

变性的协同性：变性发生在较窄的范围内。

复性：一定条件下可以恢复活性。

牛胰核糖核酸酶变性复性实验及其理论意义

蛋白质的一阶结构决定其三维结构的最有利证据。多肽链的二级结构决定于短程序列，三维结构决定于长程序列。

牛胰核糖核酸酶变性复性实验：在8M尿素或6M盐酸胍下用β-巯基乙醇处理，分子内二硫键被断裂，紧密球状结构伸展成无规卷曲构象，透析除去尿素/盐酸胍/巯基乙醇后，RNA酶活性可恢复。

二硫键相对较少，主要存在于分泌到细胞外的蛋白质，因为胞内环境相对还原，倾向于巯基保持还原状态。

蛋白质折叠动力学

折叠不是随机搜索的过程。蛋白质折叠的实质是保留局部折叠的中间体。

研究蛋白质折叠中间体：脉冲标记NMR脉冲H-D交换测定蛋白质中某些质子与周围溶剂中质子发生交换的速率。

折叠时先形成局部二级结构（成核过程），再形成结构域，装配成熔球态（疏水作用是其主要驱动作用），形成完整的三级结构。

折叠时二硫键异构酶和肽基脯氨酸异构酶起重要作用。

分子伴侣防止肽链错误折叠。

分子伴侣（molecularchaperones）：一类在序列上没有相关性但又共同功能的蛋白质，在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组分。

8.四级结构及主要特点，四级缔和在结构和功能方面的优越性，协同效应、Hill系数、Bohr效应，BPG作用机制，熟悉常见的血红蛋白分子病

四级结构：具有三级结构的组成单位（亚基）的聚合方式，特指组成蛋白质的各个亚基通过非共价键相互作用（疏水相互作用、氢键和盐键等）排列组装而成的立体结构。

四级缔和驱动力：范德华力，氢键，离子键和疏水作用；二硫键对稳定四级结构有重要意义。

四级缔和在结构和功能上的优越性：增强结构稳定性；提高遗传的经济性和效率；构成功能部位是催化部分聚集；为别构效应提供结构基础。

别构效应：结合在蛋白质特定部位上的配体对其他部位所产生的效应。

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蛋白质的结构与功能

肌红蛋白与血红蛋白

肌红蛋白功能：储存和分配氧，由一个多肽链（珠蛋白）和一个辅基血红素组成。

分析球状蛋白质的晶体结构，必须向待分析的蛋白质晶体中引进适当的重金属原子，以得到同晶置换晶体。

肌红蛋白与血红蛋白在进化中形成的多肽微环境作用：（1）固定血红素基（2）保护血红素铁免遭氧化（3）为O2分子提供结合位点。

O2的结合改变肌红蛋白的构象。

Y为给定氧压下的肌红蛋白的氧分数饱和度。K是解离平衡常数。

血红蛋白结构：四亚基

功能：运输O2及CO2

HbA1c在总Hb中比例是在红细胞生活周期内平均葡萄糖浓度的量度，临床上作为糖尿病人在两次就诊间血糖控制指标。

氧结合引起的血红蛋白构象变化，涉及空间效应与电子效应两个方面。

H+CO2BPG对血红蛋白结合氧的影响

BPG：2,3-二磷酸甘油酸，降低血红蛋白对氧的亲和力，在糖酵解（无氧）通路中，1,3-二磷酸甘油酸15-50%在二磷酸甘油酸变位酶催化生成2,3-BPG，后者经2,3-BPG磷酸酶催化生成3-P甘油酸。经此2,3-BPG侧支循环称2,3-BPG支路。红细胞中2，3-BPG磷酸酶活性远低于BPG变位酶，使2,3-BPG生成大于分解，故红细胞2,3-BPG浓度处于有机磷酸酯的巅峰，较糖酵解其他中间产物的有机磷酸酯高出多倍。

胎儿红细胞中血红蛋白由于其亚基组成不一样，血红蛋白对氧的亲和力高于成人，对BPG的亲和力较低（HbF＞HbA）。

Bohr效应：H+和CO2促进的O2释放，当H+浓度增加，pH下降，Hb的氧分数饱和曲线向右移动。有重要生理学意义：当血液流经代谢迅速的肌肉（pH低，CO2浓度高），有利于O2的释放，氧的释放促使血红蛋白与H+和CO2结合，缓冲血液pH；当血液流经肺部时，由于肺氧压高，有利于血红蛋白与氧结合，释放H+和CO2。

人的生理性或病理性缺氧可通过红细胞中BPG浓度的改变来调节对组织的供氧量。

血红蛋白分子病

镰刀型细胞贫血病：

β基因发生单一碱基突变，第六个密码子GAG（谷氨酸）突变为GTG（缬氨酸），单个氨基酸的替代形成HbS。

蛋白极性极低，疏水性上升易于结合，镰刀型细胞贫血症患者血红蛋白可形成纤维状沉淀。

在临床上，血红蛋白有3种主要形式：（1）纯合子状态及镰刀型细胞贫血（2）杂合子状态（杂合子患者可以抗疟疾）（3）血红蛋白S与其他异常血红蛋白的双杂合子状态，包括血红蛋白S-β珠蛋白生成障碍性贫血、血红蛋白C病，血红蛋白D病。

镰刀型细胞贫血症是自然选择中平衡多型现象的明显实例。

地中海贫血：血红蛋白基因突变，蛋白异常/转录过程异常。β地中海贫血：β-珠蛋白基因丢失或不能表达，每条染色体有1个拷贝，杂合子；纯合子只产生γ链，继续到童年，多数不到成熟就夭折了。

α-地中海贫血：形成同四聚体，能结合O2，无血红蛋白别构效应，向组织泄氧能力差。

免疫球蛋白的结构特征、类别与作用，了解抗原-抗体沉淀反应，ELISA、免疫印迹测定（Westernblot）、单克隆抗体制备等免疫生化分析方法。

抗体多样性：由一套免疫球蛋白基因片段经基因重排机制随机重装配而产生。

免疫球蛋白IgG由4条多肽链组成，2H2L。均由可变区（V区）、恒定区（C区）。可变区内氨基酸序列各抗体间是不同的，

H和L链都有可变区，同类重链和同型轻链的近N端约个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，可将轻链和重链区变为可变区（V）和恒定区（C）。H链上有糖基化位点。

VL和VH有所谓高变区，负责抗体分子对抗原的识别。IgG基部与两臂连接处称为铰链区。

IgG：记忆B细胞引发的再次免疫反应的主要抗体，血液中最丰富的免疫球蛋白，唯一能通过胎盘进入的抗体。

IgE：变态或过敏反应中起作用。IgE通过Fc区与嗜碱性粒细胞或肥大细胞上的特殊Fc受体结合，若结合过敏原，则诱导细胞分泌组胺和其他活性胺。

IgM：对入侵免疫抗原作初次免疫反应的早期产生的，抑制、凝集、溶解入侵血液的细菌。

IgA：存在于身体分泌物中，乳的抗体。

IgD：存在于细胞表面，功能尚不清楚。

免疫沉淀：当抗原和抗体在接近等当量浓度时，将发生最大交联，产生最大量的免疫沉淀或沉淀素（precipitin）。

多克隆抗体：由多个不同的B淋巴细胞在应答一个抗原，B淋巴细胞群中每个细胞产生结合抗原中特异的不同抗原决定簇的抗体。

ELISA（enzyme-linkedimmunosorbentassay）：酶联免疫吸附测定，以待测抗原/抗体和酶标抗体/抗原的特异反应结合为基础，通过测定酶活来确定抗原/抗体含量。步骤：（1）用样品包被表面，样品中含待检抗原和其他蛋白（2）非特异性蛋白质封闭其他未被结合的部位（3）与抗待检抗原的第一抗体孵育（4）与酶联的第二抗体温育（5）加入底物（6）形成有色产物表明待测抗原存在。

免疫印迹测定/Western印迹：对蛋白质样品进行凝胶电泳分离，凝胶板与硝酸纤维膜贴在一起，进行电泳转移，将凝胶上的蛋白条带转印到纤维膜上。通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色位置和着色深度获得特定蛋白在分析细胞或组织中的表达情况。

单克隆抗体制备：（1）用感兴趣的抗原免疫小鼠脾脏，制成B淋巴细胞悬液（2）繁殖小鼠骨髓病细胞（3）将B细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞系（4）细胞转移到只有杂交瘤细胞才能生长的培养基上进行选择性培养（5）用ELISA筛查并找出分泌目标蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株（6）对所得细胞进行扩大化培养，纯化单克隆抗体。

肌球蛋白丝、肌动蛋白丝与肌肉收缩

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蛋白质的分离、纯化与表征

1.蛋白质的酸碱性质

各个解离基团的pK值与游离氨基酸的不完全相同。短肽的等电点和净电荷量根据pK值计算，蛋白质的等电点要用等电聚焦等方法测定。

2.蛋白质分子的大小与形状

根据化学组成测定最低相对分子质量

渗透压法测定相对分子质量

沉降分析法测定相对分子质量

相对离心力（relativecentrifugalforceRCF）：由于各种离心力转子的半径或离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力受变化。RCF值不变，一个样品在不同离心机上可获得相同的效果。

沉降系数（sedimentationcoefficient，s）颗粒在单位离心场中移动的速度。

Mr=RTS20,W/[D20,W（1-γρ）]

凝胶过滤法测定相对分子质量

当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。小分子物质进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动速度较慢，使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。

lgMr=K-bVe/V0

实际应用中以相对洗脱体积Kav=Ve/Vt对lgMr作曲线，称为选择曲线。曲线斜率说明凝胶特性。每一类化合物都有各自特定的选择曲线。测定时，未知相对分子质量组分应位于直线部分为宜。若不在直线部分，可选用另一种凝胶重新试验。

SDS-PAGE测定相对分子质量

SDS：消除蛋白质构象差异，消除蛋白质自身电荷差异。SDS，十二烷基硫酸钠，阴离子去污剂，SDS单体浓度为0.5mM以上时，蛋白质与SDS就能按比例结合成复合物；SDS＞1mM时，与蛋白质结合比为1.4gSDS/g蛋白质；＜0.5mM，结合比为0.4gSDS/g蛋白质。SDS有大量负电荷，与蛋白质结合时，所带负电荷大大超过天然蛋白质原有的负电荷，消除或掩盖不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，可利用Mr差异将各种蛋白质分开。

在蛋白质溶解液中，加入SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中二硫键还原，使多肽分成单个亚单元。SDS可使蛋白质氢键、疏水键打开，引起蛋白质构象改变。

logMr=K-bX（Mrstandard——relativemigration）

3.蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀

蛋白质的胶体性质：大小在1-nm范围；同种电荷相互排斥；质点外围有水化层。

蛋白质的沉淀（破坏水化层、中和电荷）

盐析法；有机溶剂沉淀法；重金属盐沉淀法；生物碱试剂和某种酸类沉淀法；等电点沉淀。

4.蛋白质分离纯化的一般原则

前处理

粗分级分离盐析法，等电点沉淀、有机溶剂分级分离；超过滤，凝胶过滤

细分级分离：层析，电泳，结晶

5.蛋白质分离纯化方法

根据分子大小不同的纯化方法

透析：透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋中，放入透析液中，直至透析袋内无机盐等小分子降到最小值为止。

原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。

超滤：利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质透过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。超滤，膜分离技术，特点是使用不对称多孔膜根据分子大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。

超滤，适用于大分子溶液的浓缩、不同种类分子的纯化以及溶剂交换等。超滤法是一种温和、非变性的物理方法，比其他分离方法效率更高、更灵活。

超滤主要应用：浓缩，梯度分离；脱盐/纯化

密度梯度离心：用一定介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞悬浊液或匀浆置于介质顶部，通过离心或重力场作用使细胞分层、分离。这类分类可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。

凝胶过滤：分子排阻层析/凝胶渗透层析。当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入柱内网状结构，被排阻在凝胶珠之外，快速随溶剂在孔隙内向下移动，最先流出凝胶柱；比孔径小的分子，大分子先被洗脱出来，小分子后被洗脱出来。

利用溶解度差别的纯化方法

等电点沉淀和pH沉淀：等电点时，蛋白质分子净电荷为零，消除分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。

蛋白质的盐析和盐溶

盐溶：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加

盐析：当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度随盐的浓度升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出。盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。

有机溶剂分级分离：降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。

根据电荷不同纯化

电泳（PAGE，等电聚焦，双向电泳，毛细管电泳）

IEF-PAGE：聚丙酰胺等电聚焦电泳，isoelectricfocusing-PAGE，以PAGE为电泳支持物，向其中加入两性电解质载体（carrierampholytes），在电场下，两性电解质在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH值，不再涌动而聚焦成带。

双向电泳：第一向IEF第二向SDS-PAGE

毛细管电泳：消除由于热引起的扩散增加而造成对流和区带变宽。电泳迁移使所有分子朝相反电荷电极方向移动，电渗作用（electroendomosis）使所有分子向负极，但荷正电分子电泳迁移与电渗流效果一致，最先达到负极，分子通过紫外检测器把信号传递给记录仪。

离子交换层析

利用选择性吸附的纯化方法

（1）羟基磷灰石层析：羟基磷灰石HA，HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。HAPO43-基团与生物分子表面的阳电荷基团的相互反应。

（2）疏水作用层析

以苯基琼脂糖或辛基琼脂糖为固体支持物，与蛋白质表面的疏水区相互作用，用降低离子强度或增加置换剂的方法洗脱，常用置换剂为非离子型去污剂、脂肪醇、脂肪胺等。疏水作用层析容易引起蛋白质变性，在蛋白质分离中使用不广。

利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法

亲和层析：利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。

6.蛋白质的含量测定与鉴定

蛋白质含量测定

凯氏定氮法

双缩脲法

酚试剂法

紫外吸收法

染料结合法

胶体金法

免疫学方法

生物活性测定法

蛋白质纯度鉴定

常用电泳法，HPLC，免疫学方法

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