血红蛋白病基因治疗临床前研究
2019-7-12 来源：不详 浏览次数：次年之后，国际上多个研究小组应用慢病毒载体进行了小鼠（包括血红蛋白病模型小鼠）人β-珠蛋白基因转移临床前研究，评估了基因治疗效果，其中有两个研究小组的工作后续分别在年和年进行了β-地中海贫血基因治疗临床试验，我们在此重点回顾一下这两个研究小组的临床前研究（图一）。
图一、图示用于临床前研究和临床试验的血红蛋白病
基因治疗的慢病毒载体
临床前研究模型
在临床试验开展之前，血红蛋白病基因治疗的可行性、安全性和有效性需要应用一些研究模型进行评价，常见的模型有如下几种：1）β-地中海贫血杂合子小鼠（Hbbth3/+）：缺失一个拷贝的βmaj和βmin珠蛋白基因，能够部分表达成年型β-珠蛋白，临床特征类似于人β-地中海贫血中间型；2）β-地中海贫血纯合子小鼠（Hbbth1/th1）：缺失两个拷贝的βmaj，可表达βmin珠蛋白，临床特征类似于人β-地中海贫血中间型；3）重症型β-地中海贫血小鼠移植模型：将纯合的成年型β-珠蛋白基因缺失的小鼠胎肝移植到致死照射的同遗传背景小鼠，模拟人类Cooley’s贫血临床表现；4）基因敲除小鼠转基因模型：在没有内源βmaj和βmin珠蛋白基因的小鼠中转移有携带人的全长β珠蛋白基因簇的BAC，BAC可经遗传操作带有地中海贫血基因突变，如IVS2-；5）SAD（betaS-Antilles-DPunjab）镰状贫血小鼠：小鼠内源珠蛋白基因保留，转基因表达人α-珠蛋白基因和超级镰状人β-珠蛋白基因（superS，在人βS的基础上额外突变两个氨基酸）；6）BERK（Berkeley）镰状贫血小鼠：小鼠内源珠蛋白基因全部缺失，转基因表达人α-珠蛋白基因和镰状人β-珠蛋白基因（βS）。此外，裸鼠移植模型和非人灵长类也用于观察造血和红系分化过程，但是非人灵长类的HSC转导动力学可能与人和小鼠的不同（图二）。
图二、血红蛋白病基因治疗临床前研究模型
临床前研究：TheMichelSadelaingroup
MichelSadelain在位于纽约的MemorialSloan-Kettering肿瘤中心领导一个基因治疗实验室，他们在β-地中海贫血基因治疗和CAR-T肿瘤免疫治疗两方面的工作都很出色。年，MichelSadelain实验室在Nature杂志上首次报道了应用慢病毒基因转移技术在小鼠体内的人β-珠蛋白基因表达水平评估，这在当时是β-地中海贫血基因治疗研究中的突破性进展；与之相比，国际上（也包括国内刘德培院士领导的小组）大多还在进行反转录病毒载体介导的人β-珠蛋白基因研究。他们构建两种携带人β-珠蛋白基因的慢病毒重组体RNS1和TNS9，调控序列分别为短片段的HS2（bp）、HS3（bp）和HS4（bp）的组合及长片段的HS2（bp）、HS3（bp）和HS4（bp）的组合（图一），重组病毒在MEL细胞和小鼠体内前病毒整合完整，在长期骨髓重建正常小鼠体内两条鼠α-珠蛋白肽链和两条人β-珠蛋白肽链形成的杂合四聚体占总血红蛋白含量的13%。
小鼠β-珠蛋白基因的表达在发育过程中只有一个开关，即胚胎期向成年期转换的开关，这个转换发生在出生前，纯合完全缺失成年型β-珠蛋白基因的小鼠胚胎致死。杂合子小鼠（Hbbth3/+）缺失一个拷贝的βmaj和βmin珠蛋白基因，能够部分表达成年型β-珠蛋白，出生后可以存活，但贫血、红细胞大小和形态变化等临床特征类似于人β-地中海贫血中间型，因此，杂合子小鼠是评估慢病毒载体介导人β-珠蛋白基因转移效率和表达水平的一个可行模型。在杂合子β-地中海贫血小鼠中，MichelSadelain的团队发现杂合血红蛋白四聚体所占比例更高，足以缓解贫血症状，恢复正常造血功能；基因治疗一年后的小鼠中髓外造血和肝脏铁沉积明显降低，这种慢病毒载体介导的基因表达水平若应用于地中海贫血病人，是能够满足治疗要求的。
MichelSadelain的团队应用移植手段还建立了重症型β-地中海贫血小鼠模型，模拟人类Cooley’s贫血临床表现，并通过慢病毒基因转移实现了很好的基因治疗效果。他们获得纯合的成年型β-珠蛋白基因缺失的小鼠胎肝，从中制备单个核的造血细胞，用携带人β-珠蛋白基因表达盒的慢病毒转导造血干细胞，回输到经致死剂量γ射线照射的同基因型小鼠体内，与对照相比，基因治疗明显改善贫血和髓外造血等症状。
临床前研究：ThePhilippeLeboulchgroup
PhilippeLeboulch的研究小组年在Science杂志上报道了应用慢病毒载体介导的基因转移技术治疗镰状贫血小鼠模型，他们采用了T87Q突变的人β-珠蛋白基因作为结构基因，携带该突变的血红蛋白具有很强的抗镰状贫血功能，也易于通过HPLC与野生型蛋白区分开。他们分别应用了两种镰状贫血小鼠模型进行基因转移研究，一种是SAD镰状贫血小鼠，另外一种是BERK镰状贫血小鼠，BERK小鼠的贫血症状比SAD小鼠严重。慢病毒基因转移造血干细胞移植后，两种小鼠的血红蛋白浓度都有所提升，网织红细胞比例显著下降，脾、肾功能等都有所改善，外周血中平均整合拷贝数在3个左右，显示出了很好的治疗效果。T87Q突变的人β-珠蛋白基因除了用于镰状贫血基因治疗，也用于β-地中海贫血的基因治疗，而且效果很好。这个临床前研究是BluebirdBio公司开展血红蛋白病基因治疗临床试验的基础，是HPV和BB的前身。
董文吉赞赏
