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进展基因治疗一例镰刀型贫血病人

2018-2-23 来源：不详浏览次数：次

背景介绍

镰刀型贫血是最常见的单基因遗传病之一。在美国约有9万名患者，在全世界每年有27万5千新生儿患该病。镰刀型贫血是第一个分子机制被确认的疾病：年，人beta血红蛋白基因（HBB）中第一个外显子上的单碱基突变（A-T)导致的成人型的beta血红蛋白中单个氨基酸的突变（由谷氨酸变为缬氨酸）。镰刀型血红蛋白（HbS）在脱氧后聚合，降低了红细胞的可变性，病人有异常严重的血管阻塞危机，导致不可逆的损伤器官、低下的生活质量以及缩短寿命。羟基脲，一种能够在部分病人身上提高胎儿型血红蛋白水平的细胞毒素，是目前唯一被批准用于镰刀型贫血病的疾病治疗药物。

异体造血干细胞移植是目前对于镰刀型贫血病病人唯一有效的治疗方案。但是，只有不到18%的病人能够获得匹配的亲缘供者。出于治疗目的的将体外基因移植到自体造血干细胞，即基因治疗，可以给镰刀型贫血病人提供一种长期的、有潜在治愈希望的治疗方案。

我们之前报道过通过慢病毒介导表达修饰过的，编码抗镰型的HBB基因，在镰刀型贫血小鼠模型中证实了有效的，可持续的表达。这里我们报道一例在HGB-临床试验中接受慢病毒基因治疗的病人，其获得了临床完全缓解并且溶血及该病的生物标记物均已得到修正。

患者介绍

一个βS/βS基因型的男孩，并携带一段3.7kbalpha-球蛋白基因缺失，无葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺陷，在出生时即被诊断为镰刀型贫血病，随后一直在巴黎Necker医院的镰刀型贫血中心进行跟踪治疗。他有若干次血管阻塞病史，两次急性胸痛综合征以及双侧股骨头坏死。他实施过胆囊切除术及脾切除术。筛查过程中中检测到无脑血管病变特征的脑部低密度区。

男孩2-9岁间使用的羟基脲疗法并未显著改善其症状，年其接受了红细胞输血，包含铁螯合剂地拉罗司。在红细胞输血的9年里，他平均每年发生1.6起镰刀型贫血病相关的并发症。

年，在他口头同意及他母亲书面同意的情况下，他加入了我们的临床试验项目。年10月，在他13岁的时候，接受了LentiGlobinBB产品输注。

抗镰型基因治疗载体

LentiGlobinBB载体的结构见之前报道（见补充附录中图S1，也可以在NEJM.org网站找到）。这个自身激活的慢病毒载体编码了人HBB突变体βA-T87Q（译者注：蛋白氨基酸序列第87位苏氨酸突变为天冬酰胺）。这个突变体一方面能够抑制HbS多聚化之外，另一方面使得成人血红蛋白(HbA)T87Q的β-球蛋白链能够被反相高效液相色谱差异化定量。

基因治疗

为了收集到足够的干细胞用于基因转移，从患者身上两次抽取骨髓。每次收集骨髓之前都进行了输血，并且骨髓收集没有留下临床后遗症。贫血是这些步骤中唯一被报道的副作用。骨髓富集的CD34+细胞用LentiGlobinBB载体进行转染（详见补充附录中方法部分）。两批转染的细胞中外源载体的拷贝数均数为每个细胞1.0和1.2拷贝。

患者先接受静脉输注白消安进行骨髓清除，经过两天的冲刷后，经转染的细胞被回输到患者身上。移植后要持续进行红细胞输注直到能检测到大量的HbA-T87Q(总血红蛋白的25到30%)。

病人要接受随访，包括骨髓移植，毒性作用，总成核血细胞中及不同血统中载体的拷贝数，用高效液相色谱对HbA-T87Q,HbS,and胎儿型血红蛋白水平进行定量；在成核血细胞中用线性扩增的聚合酶链式反应对DNA整合位点进行鉴定；以及用抗体的酶联免疫法对能自主复制的慢病毒的定量。12个月时要进行红细胞分析

移植后基因表达

中性粒细胞及血小板分别在移植后38天及91天获得。图1A及图1B分别显示了载体拷贝数轨迹和HbAT87Q的生成。基因标记在全血，CD15细胞，B细胞及单核细胞（见补充附录中图S2）中逐渐增加，并在移植后3个月达到稳定。携带载体的T细胞的增加相对缓慢一些。HbAT87Q水平也在稳定增加（图1B）而红细胞的输注在第88天后停止。的浓度在第9月达到5.5克每分升（46%）并且在第15月增加到5.7克每分升（49%），而HbS水平呈现倒数减少：在第9月降到5.5克每分升（46%）并且在第15月降低到5.8克每分升（49%）。总血红蛋白浓度在移植后六个月之后一直稳定在10.6至12.0克每分升之间。胎血红蛋白水平则一直维持在1.0克每分升以下。

安全性

病人预期会出现白消安相关（busulfanconditioning）副作用。3级和4级不良反应事件包括4级中性粒细胞减少，3级贫血，3级血小板减少以及3级表皮葡萄球菌感染（全血培养阳性结果），所有不良反应事件已按标准方法解决。患者离院后，有4例不良反应事件报道：治疗后3个月出现下肢疼痛以及5到8个月见出现丙氨酸转氨酶，天冬氨酸转氨酶，γ-谷氨酰胺转移酶的瞬时升高。以上事件均及时得到解决。未见LentiGlobinBB–转导的干细胞相关的不良反应事件报道。自主复制的慢病毒的检测结果均为阴性。12个月中对外周血样本中整合位点的系列监测显示为持续的多克隆结果，并未探测到占优势的单克隆（定义为单个克隆占到高于30%的特定整合事件）。

临床及生化指标

病人在第50天出院。移植后第15个月后，未出现镰刀型贫血病相关的临床事件或入院。这一结果与病人开始接受常规输注之前的阶段形成有利对比。所有的药物已停止，包括止痛药。病人能够正常参加所有的学术及体育活动。8个月时的头颅磁共振成像显示皮层下白质点状低密度区。14个月时的下肢磁共振成像显示无近期的骨或组织损伤。

镰刀型贫血病相关的生物指标变化见表1

全血计数稳定，而网织红细胞计数大量减少循环的成红血球细胞则未检测到。实验室数据，包括尿微量白蛋白水平，显示正常的肝肾功能。虽然铁螯合在移植前就已停止，铁蛋白水平在移植后第15个月仍降低到微克每升，且治疗后一年时的肝脏MRI显示低铁浓度。血浆中总胆红素和乳酸脱氢酶含量已作标准化处理。可溶性转铁蛋白受体含量得到改善，是筛选时正常值的3.4倍，并且在12月及15月时高达1.5倍，表明红细胞生成速率在逐渐正常化。

因为病人在此次研究之前接受了4年的常规输血方案，同时由于在此次移植之前的交换输血，不能将移植前后的情况进行有意义的比对研究。但是病人血液中的镰刀型红细胞的比例，在治疗后的6个月及12个月显著低于未接受治疗的镰刀型贫血病病人(βS/βS)

（control1为其母亲，control3,4,5为镰刀型贫血患者）

在治疗后12月时，病人在缺氧条件下的镰型化速率，与其无症状的杂合子(βA/βS)母亲相比并无显著不同。

讨论

临床基因转移研究中有插入癌变的报道，是使用伽马逆转录病毒载体而非慢病毒载体。与伽马逆转录病毒不同的是，慢病毒倾向于插入转录活跃区域，而非靠近转录起点。此外，BB病毒上的增强子已被移除，并且它能够自体失活。此项研究资料以及其他使用BB载体治疗镰刀型贫血病患者（7例患者）及β－地中海贫血（22例患者）的研究资料显示了一致的安全性，在4到30个月内均无插入癌变的证据。

一项正在美国进行的多中心，临床一期／二期试验，HGB-，正在收集用LentiGlobin治疗镰刀型贫血病的更多资料。这项研究中对病人的随访比本研究中更有限，但关于7例病人的初期报道中并未包含安全性方面的新发现。虽然治疗性基因的表达与载体拷贝数呈相关性，基因转移的效率比本研究中低。

除了此处报道的镰刀型贫血病患者之外，该临床试验方案中还有4例依赖输血的β－地中海贫血患者接受了LentiGlobinBB治疗。这些受试者没有临床显著的并发症因而不需要常规输血。这些发现与较早前关于18例其他地中海贫血患者接受LentiGlobinBB的临床研究HGB-结果一致。目前为止观察到的有效性及安全性情况是否能维持，需要更长期的随访来证实。同时，为了证明基因疗法在镰刀型贫血病治疗上的前景尚需在更多患者中对基因疗法进行评估。

该文翻译节选自新英格兰医学杂志GeneTherapyinaPatientwithSickleCellDisease（pmid：，回复数字下载全文）

译者介绍

朱荟琳，美国IowaStateUniversity生物化学专业博士，目前就职于上海药明生物技术有限公司，从事哺乳动物细胞培养工艺开发相关研究工作。