胆道闭锁术后刘立伟刘纪民赵新

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文章来源

中华肝脏病杂志，.29（2）：-

作者：

刘立伟刘纪民罗娟杨瑞园李轲鑫朱志军孙丽莹赵新颜

DOI:10./cma.j.cn--

摘要

目的

分析胆道闭锁葛西手术后临床病理学特点及肝内免疫细胞浸润情况。

方法

纳入年6月至年3月行肝移植术患者28例，其中胆道闭锁组20例(分为未行葛西术亚组10例，葛西术后亚组10例，后者胆汁淤积消退)，对照组8例，比较其临床及病理学形态特点。肝组织切片行CD3、CD4、CD8、CD20、Foxp3、白细胞介素-17A免疫组织化学染色及定量分析。上述指标中计量资料比较采用Kruskal-Wallis检验，计数资料比较采用秩和检验或Fisher精确检验。

结果

胆道闭锁葛西术后组临床及病理胆汁淤积程度均显著低于未行葛西术组，肝纤维化程度亦显著减轻(P值均0.05)，但两组汇管区炎症程度总体差异无统计学意义(P0.05)，肝内浸润的免疫细胞类型差异有统计学意义（P0.05)。与未行葛西术组相比，葛西术后组汇管区CD3、CD8、白细胞介素-17A和Foxp3阳性细胞浸润显著减少(P值均0.05)，但两组间Foxp3/CD4阳性细胞比例差异无统计学意义(P0.05)，持续低于对照组(P0.05)。与未行葛西术组相比，葛西术后组汇管区Foxp3/白细胞介素-17A、Foxp3/CD8阳性细胞比例未见显著升高(P值均0.05)，仍持续低于对照组；小叶内Foxp3/白细胞介素-17A、Foxp3/CD8阳性细胞比例显著降低（P值均0.05)。

结论

肝内炎性细胞浸润及调节性/效应性T淋巴细胞比例失衡在胆道闭锁葛西术后胆汁淤积消退患者中持续存在，可能是促进疾病进展的一个重要因素。

胆道闭锁(biliaryatresia,BA)是最常见的儿童胆汁淤积性肝病，与西方国家相比，东亚国家发病率更高，中国台湾发病率达1.78/[1,2]，其特征为肝内外胆道进行性炎症和纤维化闭塞，如未及时治疗短时间内进展为胆汁淤积性肝硬化[3]。即使及时葛西手术(胆-肠吻合术)解除胆道梗阻，BA仍是儿童肝移植的最常见原因，约50%～80%需要进行肝脏移植挽救生命[4,5]。葛西手术后BA病情仍持续进展的原因尚不明确，与其相关的因素包括：葛西手术时已出现进展期肝纤维化，持续存在肝内炎症等，其中调节性与效应性免疫细胞比例失衡是BA发病的重要机制之一[6,7]。本研究拟比较行与未行葛西手术BA患者临床病理特征及肝组织内淋巴细胞浸润情况，探讨BA葛西术后持续进展的免疫学机制。

资料与方法

1．研究对象：

选取年6月至年3月我院行肝移植患者28例，其中非胆汁淤积性肝病患者8例作为对照组(4例鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症，4例甲基丙二酸血症)，BA组20例，包括未行葛西术患者10例，葛西术后患者10例(均为胆汁淤积完全消退患者，目的是排除葛西手术不成功以及胆汁淤积对炎症和纤维化的影响)，入选患者需符合我国胆道闭锁诊治指南()诊断标准[1]。排除标准：其他原因引起的儿童胆汁淤积性肝病。葛西手术后胆汁淤积消退定义：移植术前总胆红素≤2×正常值上限，且病理学结果显示无肝细胞淤胆及毛细胆管胆栓等急性胆汁淤积形态特征。在本研究中，所有纳入患者均发生了终点事件(肝移植)。

2．临床资料收集整理：

收集人口学资料，肝移植前检测的白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、白蛋白、前白蛋白、总胆红素、直接胆红素、总胆汁酸、凝血酶原活动度、国际标准化比值等实验室指标，并计算体质量指数、Child-Pugh评分及儿童终末期肝病模型评分[8]。

3．病理切片染色：

石蜡包埋肝组织行HE、Masson、网状纤维及罗丹宁染色。由1位肝脏病理医生及接受过肝脏病理专门培训的肝病医师采用盲法评价基本病理特征程度，评定标准见参考文献[9]。

4．免疫组织化学染色：

参照标准免疫组织化学染色方案[10]，行CD3、CD4、CD8、CD20、Foxp3、白细胞介素-17A染色，每张切片随机选取汇管区及小叶内各5个视野（×），ImageJ软件处理并行计数分析平均阳性细胞数/高倍视野。

5．统计学方法：

用SPSS21.0软件进行分析统计。计量资料用均数±标准差(xbar±s)或四分位数[M（P25，P75）]表示，计数资料用率（%）表示，3组间计量资料比较采用Kruskal-Wallis检验，并对有统计学意义的指标应用Bonferroni法进行两两比较，两组间计数资料比较采用秩和检验或Fisher确切概率法检验，P0.05为差异有统计学意义。

6．伦理委员会：

本研医院生命伦理委员会审查(批件号：-P2--01)。

结果

1．未行葛西术与葛西术后BA临床特点比较：

BA组总体年龄与对照组相当(P0.05)。与未行葛西术组相比，葛西术后组丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、总胆红素、直接胆红素、总胆汁酸均显著降低(P值均0.05)，前白蛋白显著升高(P0.05)，而γ-谷氨酰转移酶未见显著下降(P0.05)，白蛋白及国际标准化比值有所好转，但差异无统计学意义(P0.05)；Child-Pugh评分和儿童终末期肝病模型评分亦显著降低(P值均0.05)，见表1。

2．未行葛西术与葛西术后BA基本病理特征比较：

对照组纤维化程度均为S0，未行葛西术组均为S4，葛西术后组纤维化程度减轻(S2～S4)。与未行葛西术组BA相比，葛西术后组肝细胞淤胆及毛细胆管胆栓等急性淤胆指标均完全缓解(P0.05)，慢性胆盐淤积(铜沉积)有缓解趋势，但总体汇管区炎症程度未见明显缓解(P0.05)，见表2。

3．未行葛西术与葛西术后BA肝内免疫细胞浸润情况比较：

（1）B淋巴细胞浸润:与对照组相比，BA组肝内汇管区B淋巴细胞浸润(CD20+细胞)增多，葛西术后组增多更显著(P0.05)，小叶内浸润无明显变化(p0.05)。(2)T淋巴细胞浸润:BA患者肝组织中汇管区T淋巴细胞浸润(CD3、CD4、CD8+细胞)均显著增多（P0.05)。与未行葛西术组相比，葛西术后组CD3、CD8阳性细胞计数显著降低(P0.05，见图1)，小叶内T淋巴细胞浸润与汇管区一致。Foxp3是反映调节性T淋巴细胞的转录因子，BA患者Foxp3/CD4比例下降；无论是汇管区还是小叶内，葛西术后组Foxp3阳性细胞计数均显著减少(P0.05)。BA汇管区促炎白细胞介素-17A阳性细胞浸润显著增加(P0.05)，葛西术后组显著降低(P0.05)，小叶内浸润无明显变化，见表3。

图13组肝内CD8、白细胞介素-17A免疫组织化学染色(×)

4．BA葛西手术后免疫失衡持续存在：

BA患者汇管区Foxp3/白细胞介素-17A阳性细胞比例显著下降(P0.05)，Foxp3/CD8阳性细胞比例降低，但差异无统计学意义(P0.05)。与未行葛西术组相比，葛西术后组汇管区Foxp3/白细胞介素-17A、Foxp3/CD8阳性细胞未显著升高（P值均0.05），仍持续低于对照组；甚至小叶内Foxp3/白细胞介素-17A、Foxp3/CD8阳性细胞显著减低(P值均0.05)，均提示BA葛西手术后免疫失衡持续存在，见图2。

图23组汇管区及小叶内Foxp3/白细胞介素-17A、Foxp3/CD8比例

讨论

BA是儿童最严重的肝胆系统疾病，病情进展迅速、预后不佳，如不及时治疗，多于2年内死于胆汁性肝硬化或肝衰竭[3]。及时行葛西手术可显著改善患儿预后，然而术后5年自体肝生存率仅为37.9%～40.0%[11]，最终需要肝移植。目前BA的发病机制尚不明确，但无论是病毒、毒素还是其他因素造成的胆管损伤，都会激活肝内免疫反应[6]，促进肝纤维化及疾病进展。

多种免疫细胞在BA发病中起到重要作用，其中主要为效应性T淋巴细胞的激活与调节性T淋巴细胞的功能降低。在恒河猴轮状病毒诱导的BA小鼠模型中，肝内浸润的CD3、Th1、Th17和CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞和枯否细胞增加并激活，过度产生干扰素-γ、白细胞介素-6和白细胞介素-17等细胞因子，进一步诱导胆管损伤和阻塞、肝纤维化和肝硬化，促进疾病进展[12,13,14]，而具有免疫抑制功能的Tregs细胞已被证明在BA中具有保护作用，Tregs比例降低、功能减弱可能与BA的发病机制有关[15,16]。与既往研究一致，我们的研究中，BA患者肝内T淋巴细胞、B淋巴细胞浸润均增加，T淋巴细胞浸润主要是以Th17与CD8+T淋巴细胞浸润为主，Tregs比例显著降低。

BA患者经过成功的葛西手术可以解除胆道梗阻，改善胆汁淤积[17,18]，肝功能储备随之改善[19]，那么到底是什么原因导致疾病持续进展，最终需要肝移植挽救生命呢？葛西术后肝内炎症及免疫失衡是否恢复尚罕见报道。我们排除葛西手术不成功及胆汁淤积对肝内炎症浸润的影响，选取了葛西手术后胆汁淤积完全消退且最终行肝移植手术患者为研究对象，与未行葛西术者进行比较。与我们纳入标准一致，葛西术后患者临床及病理胆汁淤积完全缓解，肝纤维化程度也显著减轻，但是患者总体汇管区炎症浸润程度差异无统计学意义，表明胆汁淤积消退后，肝内炎症仍持续存在。

葛西手术后胆汁淤积消退后肝内效应性及调节性T淋巴细胞浸润均减轻，但其比例仍未恢复。Liu等[20]发现，在BA动物模型中Th17细胞增加，Tregs减少，在Tregs/Th17细胞抑制试验中，白细胞介素-6麻痹了Tregs对Th17细胞的抑制作用，后者持续增多加重胆管损伤。我们在BA患者中也发现，Foxp3/白细胞介素-17A比例显著降低，表明存在肝内免疫调节紊乱；葛西术后白细胞介素-17A分泌显著减少，由于Foxp3+细胞亦显著减少，Foxp3/白细胞介素-17A的比例持续低水平，表明葛西术后免疫失衡持续存在。本研究除外葛西手术不成功及胆汁淤积等因素对肝内炎症的影响，规范的免疫组织化学对参与BA肝内炎症的免疫细胞种类进行定量分析；但是纳入病例数较少，未与外周血免疫情况相关联，研究结果需要扩大样本量进一步验证。

参考文献

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