比较早期和晚期糖尿病肾病的肾脏转录谱揭示

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发表期刊：Diabetes

影响因子：7.

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发表时间：October2,

目录

基础知识

生物学基础

统计学基础

缩写

研究背景

研究方法和结果

方法

结果

讨论

优点和局限性探讨

优点：

局限性：

总结

基础知识生物学基础

1）肾切除：是一种治疗肾脏疾病的外科手术。用于a.肾恶性肿瘤2.肾结核　一侧肾已大部分或全部被破坏，另一侧肾正常或病变较轻，肾功能基本正常。在控制其他部位活动性结核之后，可将已被破坏的肾切除。

2）癌和癌旁：肿瘤组织就是病灶部位的组织，癌旁一般指距病灶2cm的组织，癌旁不同于正常，是non-tumor。

3）肾活检标本：又称肾活体组织检查（renalbiopsy），指利用穿刺或外科手术的方法从患者的肾脏中获取少许的肾脏活体组织进行病理学检查。该检查是明确肾脏疾病的性质和病理类型的重要检查方法，对确定疾病的治疗方案和判定预后有重要的意义。

4）糖尿病肾病的分期：

Ⅰ期：这一期主要的以肾小球滤过率增高和肾体积增大为特征。这种初期的病变与患有高血糖的水平是一致的，但是可逆的，医院给予的胰岛素治疗可以得以恢复，但是专家解释会所不一定能完全的恢复到正常的状态。

Ⅱ期：该期患者的尿白蛋白排出率已呈现正常但肾小球已出现结构上的改变。这期肾脏内尿白蛋白排出率(UAE)正常(20μg/min或30mg/24h)，运动后UAE增高组可恢复。肾小球毛细血管基底膜(GBM)开始增厚，系膜基质开始增加，GFR多高于正常范围并与血糖水平呈现一致，GFRmL/min患者的糖化血红蛋白常9.5%。GFRmL/min和UAE30μg/min的病人更易发展为糖尿病肾病的可能很大。

Ⅲ期：此期又被叫做是早期糖尿病肾病。患者肾脏尿白蛋白排出率为20～μg/min，病人的血压出现轻度的升高趋势，开始出现肾小球的功能减退。

Ⅳ期：是临床上的糖尿病肾病或显性的糖尿病肾病。这一期的特点是患者开始出现大量的白蛋白尿(每日大于3.5克)，水肿和高血压。糖尿病肾病患者的水肿开始变得比较严重，对利尿药反应差。

Ⅴ期：即为终末期肾功能衰竭期。糖尿病病人一旦出现持续性尿蛋白就有可能发展为糖尿病肾病，由于肾小球基膜广泛增厚，肾小球毛细血管腔进行性狭窄和更多的肾小球坏退，肾脏滤过功能进行性下降，导致肾功能衰竭。

统计学基础

t检验、相关分析(Pearson相关分析)、回归分析(线性回归模型)

缩写

肾小球硬化（GS）

糖尿病肾病（DN）

研究背景

1）直接原因：糖肾会导致严重后果，虽然有控制，但是患病人数仍在增多，阐明早期的机制有助于新的预防和治疗靶点。全基因组基因表达谱分析有助于提供疾病发病机制的全局图景，并识别DN的潜在新Biomarker和药物靶点。

2）国内外研究现状：通过研究人类糖肾(包括组织及肾小球和肾小管间质)的转录本，证实NF-kB炎症途径与DN发展密切相关；VEGF-A在DN表达下调，与间质血管系数有关；证实JAK-STAT通路上调；RhoA、Cdc42、整合素表达上调，DN肾小球室VEGF信号及肾小管间质室炎症相关通路的研究；发现肾小管间质体积分数是肾小管间质损伤的一个指标，与富含与线粒体功能障碍、炎症、迁移机制和肾小管代谢功能相关的转录物显著相关；其中SLIT-ROBO-GTP酶激活蛋白2a（SRGAP2a）是DN患者蛋白尿和eGFR的关键基因。

3）本文研究：

首先，对early和advancedstage的DN患者的整个肾脏活检样本与来自非糖尿病性肾切除术样本的正常肾组织样本RNA序列（RNA-seq）分析。

然后，比较了正常、早期和晚期DN的基因表达谱，对DN患者的肾功能（eGFR）和组织学参数进行了相关分析。

紧接着，挖掘单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据反褶积分析，以确定正常和患病肾脏中存在的不同细胞类型。

最后，通过对这些患者的肾组织进行免疫染色验证一些关键的发现。

数据和资源可用性：本研究生成和分析的RNA-seq数据集可从GEO存储库（GSE）获得。

4）技术路线

研究方法和结果方法：1.获取人肾活检标本：

地点：上海交通医院

时间：年1月至年12月

方法：超声引导肾活检收集肾组织后-80℃保存，进行分组。

baseline:

2.RNA测序与生物信息学分析：

流程描述：提取总RNA与检测→RNA质检→构建文库→BGI(HiSeq)测序→读段(reads)与人类参考数据库比对(读段质量良好)**→**过滤→计算为对应转录本表达水平→筛选低读取（）的转录本→归一化(读取计数经log2转换，并且在相等的全局中值处进行分位数标准化，以便比较样本间的转录水平)

数据分析：

首先，基因表达数据通过年龄和性别等人口统计学混杂因素进行调整通过从线性回归模型中提取残差。

然后，主成分分析以评估总体样本分布。采用LIMMA检验进行差异分析，以确定p值0.05（晚期DNvs早期DN，由于DEGs数目多使用FDR0.05）和FC(变化倍数)为1.5时显著失调的基因，然后通过Fisher精确检验进行GO功能（10）和途径（KEGG，IngenuityIPA,BIOCARTA,NABA,Panther,PID,REACTOME,Wiki-pathway）富集分析。

其次，对所有DN标本（包括早期DN和晚期DN）进行基因表达、eGFR和组织学评分的相关性研究。ps.采用Pearson相关分析法检测FDR0.05时eGFR相关基因。与组织学评分的相关性通过多元分析确定，采用线性回归模型，p值0.05。

最后，从GEO数据库挖掘scRNA-seq数据集：GSE（人类肾移植活组织检查单细胞数据集）和GSE（小鼠单细胞测序数据）→Seurat识别16种细胞类型→每种细胞类型的基因表达值间进行比较→t检验p值0.01和log2FC0.5的基因作为相应细胞类型的标记→每个标记计算每个单元类型中的平均表达式值，以构造用于反褶积分析的基矩阵。注：在反褶积分析中利用CIBERSORT方法，根据批量测序样本中标记的表达值，估计每种细胞类型的百分比。

3.组织学评价：

肾活检样本→经HE染色、高碘酸希夫染色和Masson三色染色→详细组织学特征评分。

4.肾切片免疫染色：

样本：早期DN5例，晚期DN44例，癌旁正常组织7例。

染色：所有5例早期DN患者、5例晚期DN患者（随机选择出）和5例肾切除术患者→特异性一级抗体和生物素化二级抗体（VectorLaboratoriesInc.）进行免疫染色→用亲和过氧化物酶（VECTASTAINElite；VectorLaboratoriesInc.）显色。

用抗Mrc1对巨噬细胞（ab，Abcam）、CD3对T细胞（A，Dako）和CD20（M，Dako）对免疫细胞进行免疫染色。

观察：载玻片安装在AquaPoly/Mount（Polysciences公司）中，并在奥林巴斯BX60显微镜下用数码相机拍摄。

抗体：RBP4（ab，Abcam）和GRP1（ab，Abcam）。

评分：根据阳性染色面积除以每个患者肾切片中的肾皮质总面积的百分比，半定量地对肾活检中的肾染色程度进行评分。

结果1.DN患者肾活检RNA序列分析：

RNA-seq数据的主成分分析（PCA）显示了三个不同的组（Fig1），表明三个组之间的总体基因特征发生了很大变化。

早期DNvs对照组：

差异分析：前50的DEGs（p值0.05，foldchange1.5或-1.5）。在前25个下调基因中，转录因子EGR1、EGR2、EGR3、JUNB、FOS、FOSB和ATF3以及与DN肾损伤相关的炎症标志物IL6和CXCL2参与DN的发病。

GO分析：显示早期DN上调基因的top-GO项与细胞收缩、肌球蛋白和肌动蛋白基因、激素调节和视知觉有关，包括维甲酸途径中的几个基因（如RDH8、RDH12和RBP4）。维甲酸途径在几种肾脏疾病动物模型中具有肾脏保护作用（19；20）。有趣的是，胰高血糖素样肽-1受体（GLP1R）的表达在早期DN也高度上调。

pathway富集分析：许多下调的基因与免疫应答有关，提示早期DN患者的炎症途径与对照组相比受到抑制。这可能是由于早期DN患者的肾脏炎症状态较低，但可能是肿瘤周围正常组织的肾切除术样本炎症轻度增加所致。

晚期DNvs早期DN：

差异分析：许多基质和炎症相关基因在晚期DN中上调。

GO分析：上调基因的top-GO项与免疫应答有关，而下调的DEGs主要是运输和代谢过程。

pathway富集分析：pathway变化与基质细胞、纤维化、炎症和代谢有关。与晚期DN患者肾脏中观察到的高水平炎症、肾小管功能障碍和代谢失调相一致。

对照组vs早期DNvs晚期DN：

小结：

图C，D中基因以及GO分析提示维甲酸和GRP1R激动剂可能对早期DN有保护作用，从而阻止糖尿病患者DN的进展。

图E，F中基因以及GO分析提示这些基因可能通过增强炎症参与DN的促进。

2.DN患者eGFR与基因的相关性研究：

经基因与DN患者eGFR的GO分析以及途径富集分析表明，与eGFR高度相关的途径有与铁转运和细胞分化相关的途径、免疫应答、吞噬调节、小G蛋白调节（RhoA和Rac1）、纤维化和炎症途径。

DN患者基因与肾脏组织学评分的关系：

图中总结了所有DN样本中与组织学评分相关的最丰富GO通路。节段性肾小球硬化（GS）、动脉硬化等5个组织学参数有不同的GO项，突出了DN肾脏不同病理变化的潜在分子机制。

3.肾细胞scRNA-seq数据的去卷积：

R中CIBERSORT算法对数据集进行去卷积，以估计不同肾细胞类型的相对分数。

晚期DN的近端小管和集合细胞明显减少。早期和晚期DN的内皮细胞都减少，表明肾脏（肾小球和肾小管周围）内皮细胞损伤可能发生在早期DN。晚期DN患者的单核细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞、B细胞和浆细胞增加。

随着晚期DN的发展显示巨噬细胞显著增加，T和B细胞都有少量但显著的增加。晚期DN的肾小管细胞明显减少。

然而无法了解足细胞的变化，因此比较了肾小球和肾小管细胞特异性标记物的表达，发现晚期DN患者足细胞和肾小管细胞特异性标记物均减少。

由于肾细胞群的变化可能会影响数据分析，重新检查了从早期DNvs对照组和晚期DNvs早期DN的DEGs和GO通路，并根据去卷积分析估计的细胞群差异进行调整后的分析，基本上显示了与未经调整的分析相似的结果。

此外还将本研究中的DEGs与（GSE）和（GSE）肾小球和肾小管转录本的微阵列分析。结果显示DEGs中约有30%的重叠，而在大多数富集途径中超过60%的重叠。因为分别为肾活检的组织和肾小球肾小管的组织。

4.免疫组化验证RNA测序数据结果：

1）对早期DN增加而晚期DN减少的基因特别感兴趣(可能代表对DN进展有保护作用的基因)。选择视黄醇结合蛋白4（RBP4）和GLP1R在DN患者肾脏切片中进行进一步的免疫染色验证，因为在糖尿病肾脏中的表达没有很好的特征性。结果证实RBP4和GLP1R在早期DN时升高，但在晚期DN时降低。RBP4染色在DN早期主要定位于肾小管细胞，在DN早期主要与肾小管细胞共定位，近端小管标记AQP1，而晚期DN的肾脏染色很弱（图A）。GLP1R定位于DN早期肾小球和近端肾小管细胞，与AQP1共同定位于肾小管间室，但晚期DN的染色也很弱。

2）对于晚期DN增加的基因，选择了两个免疫应答基因进行免疫染色验证，晚期DN肾脏中IL-6和IL-1B的表达显著增加，但早期DN肾脏中表达不明显。

3）对免疫细胞的标记物进行了免疫染色验证去卷积数据的发现。结果发现与早期DN相比，晚期DN的M2巨噬细胞标记MRC1染色显著增加。与早期DN相比，晚期DN肾脏中T和B细胞标记CD3和CD20的染色也显著增加。

小结：结果与去卷积分析一致，支持了免疫细胞在DN进展中的重要作用。

讨论

在早期DN中高表达但在晚期DN中被抑制的基因，如维甲酸途径和GLP1R（RBP4和GLP1R在患者肾组织中的表达得到抑制），可能代表了一组在DN早期具有肾脏保护作用的基因，符合这些病人的非进展性。

RBP4的作用是将视黄醇传递到靶组织，并显示其与糖尿病患者的肾功能相关。维甲酸（RA）在体外和肾脏疾病动物模型中具有保护作用。最近的研究表明，RA的局部合成在患病的肾脏中受到损害，并有助于肾脏疾病的进展。RBP4的遗传变异与早期DN有关，而与晚期DN无关。需要进一步研究RBP4在DN进展中的作用。

GLP1R激动剂在动物模型和DN患者中具有肾脏保护作用。GLP1R在DN早期肾脏局部表达增加，以保护肾脏免受损伤。GLP1R的免疫染色显示，在DN早期，其在肾小球和肾小管细胞中的表达确实增加。GLP1R如何介导其激动剂在局部肾细胞中的作用尚需进一步研究。

免疫反应或炎症基因的表达在早期DN中受到抑制，但在晚期DN中高度上调。DN早期免疫应答基因的抑制可能部分归因于对照组炎症状态的轻度升高从肾切除术样本。但更可能的是，这些早期DN患者不是进展者，对DN的进展有抵抗力，因此炎症被抑制。晚期DN患者免疫应答和炎症基因的显著增加证实了炎症在DN进展中的关键作用，表明Jak-Stat和NF-κB通路在糖尿病肾脏中高度富集，结果：炎症在DN进展中发挥关键作用。

小结：巨噬细胞和免疫应答在DN进展中发挥重要作用，肾小管细胞损伤是DN发生发展的原因之一，肾小管间质损伤的一个指标-皮质间质分数容积与富含线粒体功能障碍、炎症、迁移机制和肾小管代谢功能相关途径的转录物显著相关。

优点和局限性探讨优点：

1）微阵列分析的局限性在于，并不是所有的基因都能用现有的芯片检测出来，使用RNA测序的方法来研究糖尿病肾脏的转录组。

2）研究还提供了糖尿病肾脏中非编码RNA变化的数据。例如，在早期和晚期DN之间的DEG中发现了几个非编码RNA，包括LOC、LOC、LOC507537、LINC和LINC。miR-在DN早期较对照组上调，miR-是一种通过p53依赖途径调节细胞凋亡的有效调控因子。

3）尽管只有6例临床和活检证实的早期DN患者的样本，但转录组数据为DN的早期发病过程提供了有用的信息。这6名患者的糖尿病病程和其他临床参数与晚期DN患者相同，因此可能是DN的“非进展者”。为了进一步支持这一点，对这6名患者进行了2-3年的随访，发现他们的肾功能和UACR稳定。先前的研究仅包括晚期DN患者，而早期DN的唯一其他肾转录组在Pima-Indian研究中进行。由于我们的研究对象是亚洲人，因此比较不同种族背景的DN患者的转录组数据将有助于进一步的研究。

局限性：

1）每种技术方法各有优缺点，但可以相互补充了解DN的发病机制。scRNA序列检测到的基因的深度和数量仍然有限；体测序深度和数量符合要求，但结果并不能准确定位发病机制。

由于肾皮质主要包含肾小管间质室，转录组数据将主要反映该室细胞的mRNA表达；然而去卷积分析确定的最大细胞类型是近端小管。虽然分离肾小球可以得到关于肾小球细胞的更具体的信息，但这些数据仍将代表异质性肾小球细胞类型。

为了解决这个问题，在小鼠体内从荧光标记的细胞中分离了特异性肾小球细胞（在人体组织样本中做不到）。然而，与体RNA测序相比，scRNA序列检测到的基因的深度和数量仍然有限。scRNA-seq数据可能会受到消化过程的显著影响，因为它需要更严格地将肾组织消化成单个细胞。此外，由于可获得的材料数量有限，对人肾活检样本进行scRNA-seq的消化很困难。

2）尚未证实早期DN患者成熟miR-是否确实上调。

3）通过挖掘scRNA序列数据集估计DN中特定肾细胞类型的变化，通过肾切片进行免疫染色进行证实。因此，还需要数据进一步支持分析的细胞如巨噬细胞在人类DN发病机制中的关键作用。从DN患者获得更可靠的scRNA-seq数据时，这种方法将得到显著改善。

4）需要进一步的研究来确定DEGs是如何促进DN中观察到的特定病理变化。

总结

DN的典型病理特征是肾小球、肾小管间质和血管损伤。不同的病人可能会在其中一个部位出现比其他部位更多的损伤。为了确定糖尿病肾病（DN）进展的相关因素，对早期DN、晚期DN和正常肾组织的肾活检标本进行了RNA测序，研究了早期和晚期DN患者肾脏转录物与个体病理学评分的关系。

一组早期上调但晚期下调的基因在很大程度上具有肾脏保护作用，包括维甲酸途径和胰高血糖素样肽-1受体（GLP1R）基因。

另一组早期下调但晚期上调的基因主要是与肾脏疾病发病相关的基因，如与免疫应答和纤维化相关的基因。与eGFR相关的基因在铁转运和细胞分化途径中与eGFR呈正相关，而在免疫应答和纤维化途径中与eGFR呈负相关。与各种组织病理学特征的相关性也确定了与不同基因存在途径的关联。

对RNA-seq数据集的去卷积分析表明，晚期DN肾脏中单核细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞显著增加。

该研究为DN进展提供了潜在的分子机制，为早期和晚期DN患者的功能和结构改变与DEGs表达的关系链接。

说明：看这篇文献是因为涉及转录组学和糖尿病肾病，而我研究方向为生物信息学、糖尿病肾病和临床代谢组学，在补各方面的知识。