蛋白桑桑叶降糖活性物质DNJ分离纯化及

摘要目的：１．采用高效液相色谱一蒸发光检测（ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ）法建立一种稳定、可靠、重现性好的桑叶生物碱ＤＮＪ（卜脱氧野尻霉素）含量测定方法；并且以ＤＮＪ含量为评价指标，在单因素实验基础上，运用响应面分析法（ＲｅｓｐｏｎｓｅＳｕｒｆａｃｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）优选桑叶生物碱提取工艺：２．以ＤＮＪ含量为评价指标，筛选分离纯化桑叶生物碱效果最优的阳离子交换树脂，并考察其上柱液流速、洗脱液浓度及洗脱液流速等影响因素，进而得到最佳分离纯化工３．考察桑叶生物碱对淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶体外抑制活性试验方法；同时，进行酶活性抑制反应条件优化及酶动力学研究，考察桑叶生物碱对其酶活性抑制药理活。

方法：１．采用高效液相色谱一蒸发光检测（ＨＰＬＣ—ＥＬＳＤ）法建立桑叶中生物碱含量检测方法，通过单因素及响应面分析法实验，考察乙醇浓度、ｐＨ值、料液比及浸提时间４个因素对提取率的影响，得到桑叶生物碱的最佳提取工艺；２．以ＤＮＪ生物碱含量为评价指标，进一步筛选出分离纯化效果最佳的树脂类型；通过考察上柱液流速、洗脱液浓度及洗脱液流速等三个因素，得到桑叶生物碱最佳分离纯化工艺：３．体外模拟Ｑ一葡萄糖苷酶反应体系，应用三种Ｑ一葡萄糖苷酶，即淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶试剂盒，分别进行桑叶生物碱的酶活力抑制率测试实验，利用Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ双倒数做图法，进一步确定最佳反应体系及酶抑制动力学类型。结果：１．采用ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ法，以ＤＩＫＭＡＰｌａｔｉｓｉｌＮＨ２（４．６ｍｍ２５０ｒａｍ，５ｕｍ）为色谱柱，流动相为乙腈一水（９０：１０）、流速为１．Ｏｍｌｍｉｎ－１、ＥＬＳＤ漂移管温度４０、及载气流速为３．５１０５Ｐａ等条件建立生物碱含量测定方法；方法学考察结果显示０．３５６２．８４８１．ｔｍＬ。１范围内质量浓度与峰面积呈良好线性关系、同时精密度ＲＳＤ＝Ｏ．５４％、稳定性ＲＳＤ＝Ｏ．９８％、重现性ＲＳＤ＝Ｉ．４６％、平均加样回收ＲＳＤ＝２．７５％等各项指标均显示此种方法不止精密度高，稳定性和重现性优，且加样回收率亦显示此种方法可行：采用ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ方法来测定桑叶生物碱的含量，确定桑叶生物碱提取的最佳工艺参数为乙醇浓度６６．５３％、ｐＨ值为６．６６、浸提时间２．７３ｈ；在此条件下，桑叶生物碱实际提取量为０．１９４６％，较以前的文献研究提取量有明显提高，并且通过３次重复验证试验，结果显示桑叶生物碱ＤＮＪ平均提取量为０．１９６７％，ＲＳＤ为０．２３％。

桑叶降糖活性物质ＤＮＪ分离纯化及其体外药理海出研究引言糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ）是一种功能性胰岛减退和胰岛素抵抗类疾病，同时，伴随人体五大营养成分，即蛋白质、脂肪、糖类、电解质和水等代谢紊乱。其发病机制尚不明确，科学家研究发现可能是由遗传因素、精神因素、免疫功能紊乱等多种复杂致病因子相互作用导致。临床症状除了有高血糖还可出现多尿、多饮、多食、消瘦即“三多一少”等表现的症状，并且，如果糖尿病（血糖水平）控制及治疗一旦不当，即会引发相关急慢性并发症，继而导致。肾、足、眼等部位病变衰竭，且多无法治愈。如今，糖尿病为世界性三大疾病之一，发病率亦不容忽视，已达到１％～５％，。国际糖尿病联盟统计数据显示，上世纪９０年代糖尿病患者的数量约达到ｌ亿余人，截止至２００７年糖尿病患者人数增长率急剧攀升，已经增长至２．５亿人次患病，据ＩＤＦ组织权威预测，在２０２５年全球范围内糖尿病及其相关急慢性患者并发症将可能高达３．８０亿人次。据国家卫生部调查显示，国内每天新增病例数约为３０００例，每年增长约为１２５万糖尿病患者，其中ＩＩ型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）患者约占９５％，ＩＩ型糖尿病及其急慢性并发症给患者及其家庭所带来的危害，让其成为全球性重大公共卫生威胁和挑战。在现代医学中西药为临床治疗糖尿病及其并发症的主流方式，但西药治疗在临床上普遍存在毒副反应大的问题：其中，胰岛素和磺脲类降糖药物均可使患者体重增加，并使其罹患低血糖的风险升高；另外，一糖苷酶抑制剂和二甲双胍等降糖药物则会引起消化道等不适反应。然而，中医药传统治疗手段具有的较高安全性则是西药疗法无法比拟的，并且相对西药而言，患者更易接受；再者，中医药治疗疾病克服了大多数西药药效途径单一等缺点、中医药治疗疾病具有毒副作用小和不良反应少等特点，并且，对于糖尿病治疗效果而言，运用祖国中医药两大特点，即整体观和辨证论治才能从根本上解决，达到标本兼治的治疗目标１。桑叶是中医药传统治疗常用的中药材，据《本草纲目》载：桑叶乃手、足阳明之药，治劳热咳嗽，明日长发，止消渴。现代药理学研究者们得出结果表明其不仅具有降血糖、调血脂、更有抗炎、抗氧化和衰老等作用，特别是在对糖尿病及其各类并发症的预防和治疗方面具有药性平和、作用广泛、毒副作用小和安全性高等特点。文献研究显示，桑叶是有效的辅助治疗食物，具有多种保健养生Ｈ墩用，更有商业化价值。国内外，尤其亚洲多国市场已出现将桑叶制成茶剂饮服的商品，可能是桑叶黄酮类，生物碱类和多糖类三种提取物皆可在开水浸泡条件下有效发挥调节患者血糖生理指标的功效。Ｐａｒｋ等拍３和Ｎａｏｗａｂｏｏｔ等阳１研究者通过灌胃连续给药方式考察桑叶有效成分水提物对糖尿病小鼠模型的治疗机制发现小鼠餐后血糖明显得到改善，其作用机制可能为非竞争性抑制Ｑ一葡糖苷酶活性，从而有效控制糖尿病小鼠模型餐后血糖异常升高的病理现象，达到显著降低其血糖水平的治疗效果。广州中医药大学２０１４届硕士学位论文日本有学者深入研究了桑叶降糖的生物活性，结果发现：一类天然含氮化合物及其衍生物为桑叶中主要活性成分，其中，研究较多者是一种天然葡萄糖结构的类似物卜脱氧野尻霉素（卜ｄｅｏｘｙｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）一ＤＮＪ。天然生物碱类成分ＤＮＪ具有竞争性抑制ｄ一葡萄糖苷酶活性，不仅能够调节餐后血糖水平异常升高，亦可改善糖尿病常见并发症，颇具治疗优势ｎ“。原爱红等研究者发现桑叶提取物三种具有糖苷酶抑制活性成分（生物碱、黄酮、多糖）中活性最强的为天然生物碱类成分ｕ…。Ｗｏｎ—ＨｏＫｏｎｇ啪１等研究者在研究糖尿病模型小鼠时，以灌胃给药方式连续喂养桑叶生物碱ＤＮＪ提取，实验结果亦发现小鼠餐后血糖水平明显降低，同时胰岛素敏感性增强，双管齐下达到治疗小鼠糖尿病的药效。Ｋｉｍｕｒａ等瞳”研究结果表明Ｎ一甲基一卜脱氧野尻霉素、ＧＡＬ—ＤＮＪ和ｆａｇｏｍｎｉｎｅ生物碱对链脲佐菌素糖尿病模型小鼠可显著降低其血糖水平。黄酮类为另一种桑叶降糖有效成分，为植物茎叶中含量较高的天然活性成分，其约占桑叶干质量１％～３％。ＳＵＮＹＫｕｌ等研究者利用丁醇提取分离桑叶有效成分后得到９种黄酮类化合物；还有学者对桑叶总黄酮部位进行提取纯化工艺研究“。李向荣ｕ州等研究者得出实验研究结论表明：桑叶中总黄酮类能够有效抵抗ＴｒｉｔｏｎＷＲ一１３３９诱导糖尿病小鼠模型中血清ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ—Ｃ等指标的升高，同时可明显升高血清中ＨＤＬ—Ｃ／ＴＣ和ＨＤＬ—Ｃ／ＬＤＬ—Ｃ水平的比值，并且模型小鼠在给药后１２ｈ药理作用效果更为明显；高脂饲料喂养大鼠模型也同样表明桑叶总黄酮具有降低血脂的作用，而且具有剂量相关性和依赖性，这为开发桑叶治疗糖尿病相关并发症的药效提供了机制上的支持。另有研究得出结论：桑叶黄酮类活性成分可以调节糖尿病小鼠空腹血糖值、餐后血糖ＡＵＣ等指标异常现象，并且桑叶黄酮类活性成分能够改善控制ＩＩ型糖尿病常见并发症即肾病的药理作用““。任丽萍ｎ２。等研究者通过研究糖尿病模型大鼠，利用口服灌胃给药桑叶黄酮和多糖治疗，发现ＳＴＺ糖尿病大鼠血糖值明显下降，胰岛素升高，ＴＣ、ＴＧ显著降低，其研究结果表明桑叶黄酮和多糖类成分对糖尿病有一定的治疗效果，其机制可能是通过维持胰岛结构的完整性和调节胰岛素的分泌有关。天然多糖（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）是由１０个以上单糖通过糖糖苷键结合而成的糖链天然聚合高分子碳水化合物，临床上作用广泛，包括调节免疫、抗病毒及癌症、降血糖和美容等生物活性。桑叶中即富含多糖类天然活性成分，研究者通过对桑叶多糖结构的研究得到了其一级结构为ＭＰＡ－Ｉ，同时对其进行了一系列衍生物类似物的结构鉴定，从而得到其最优提取纯化工艺，为桑叶多糖类成分降血糖的新药开发奠定了相关化学试验基础，并且通过方法学各项指标的考察表明提取纯化工艺稳定可行。这些研究为表明桑叶的药效物质基础提供的数据。研究者ｎ铂在桑叶多糖类成分的降糖机制考察中，发现桑叶多糖提取物在治疗糖尿病模型小鼠症状的机制可能与桑叶多糖能够增加模型小鼠胰岛素分泌量，从而达到改善糖耐量等糖尿病症状的药用效果，并且，随着给药量的增加，模型小鼠血液胰岛素水平呈正相关比例增长，同时，空腹血糖值呈负相关比例减少。任丽萍ｎ２３等研究者在考察桑叶多糖和黄酮复合成分治疗糖尿病大桑叶降糖活性物质ＤＮＪ分离纯化及其体外药理活性研究鼠模型时，发现两者复合成分可能是通过促进糖尿病大鼠胰岛素分泌水平和修复胰岛细胞，继而达到调节糖尿病大鼠血糖水平和血液甘油三酯和胆固醇水平的目的。基于以上文献研究基础，本实验室研究者已经做了大量关于桑叶降糖成分多糖类和黄酮类的提取工艺考察和降糖机制的研究，且证明了桑叶中多糖和黄酮类成分具有一定的降糖作用。然而，大量文献表明桑叶生物碱类成分，尤其是脱氧野尻霉素（ＤＮＪ）可能是更重要，更有效的降糖成分。本课题研究的主要目的在于单因素考察的基础上，对桑叶总生物碱提取工艺的影响因素和水平，即乙醇浓度、酸浓度、料液比、提取时间等进行初步考察，在此基础上利用响应面分析法（ＲｅｓｐｏｎｓｅＳｕｒｆａｃｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）优化桑叶总生物碱的提取工艺，并且运用不同型号的离子树脂考察分离、纯化桑叶总生物碱的工艺，进而研究桑叶中生物碱类成分对Ｑ一葡萄糖苷酶活性的抑制作用，旨在为糖尿病的临床治疗开发药物，提高治疗效果。广州中医药大学２０１４届硕士学位论文桑叶降糖活性物质ＤＮＪ分离纯化及其体外药理活性研究第一章文献研究第一节糖尿病、临床治疗现状及中医药治疗进展一、糖尿病概述及ＩＩ型糖尿病糖尿病（ＤｉａｂｅｔｅｓＭｅｌｌｉｔｕｓ，ＤＭ）是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损而引起的一组以高血糖为主要特征的代谢性内分泌疾病。其主要病因可以概括为以下两方面：一为遗传异质性明显，即存在明显的家族发病倾向，其中Ｉ型糖尿病以ＨＬＡ抗原基因ＤＱ位点为典型的多基因位点发病机制，ＩＩ型糖尿病则以胰岛素受体基因、胰岛素基因、线粒体基因及葡萄糖激酶基因等位点为发病机制；二是环境因素，即现今社会常见的进食多运动少等生活方式导致的肥胖为ＩＩ型糖尿病遗传易感发病病因，Ｉ型糖尿病则表现为免疫系统异常诱发的胰岛素Ｂ细胞破坏。糖尿病的临床表现分为两种：一类是饮多尿多食且消瘦的“三多一少”症状，此症状多见于Ｉ型糖尿病患者；另一类则多见于ＩＩ型糖尿病，表现为疲乏无力，肥胖。目前，除了以上提到的两种糖尿病类型，还有如妊娠糖尿病及非特异性糖尿病，其中ＩＩ型占到整个比重的９３％以上。ＩＩ型糖尿病容易引起多种严重的急性、慢性并发症，造成多器官功能性病变，甚至会致残、致死，给个人带来痛苦、家庭社会带来负担。由ＩＩ型糖尿病诱发的慢性并发症患病率高达６５％以上，主要包括肾脏，眼，高血压及心脑血管疾病，约占三分之一乜２｜。其中，心血管并发症已成为国内危害性最大的并发症，患病率亦高达１７％。ＩＩ型糖尿病已经成为本世纪最大的公共卫生问题之一，威胁着人类的健康及生存，因此ＩＩ型糖尿病的预防、治疗及控制亦成为全球性的严峻挑战。二、ＩＩ型糖尿病临床治疗现状目前，临床上对于ＩＩ型糖尿病的治疗有直接注射胰岛素类药物及口服降血糖药两种方案。前者，即注射胰岛素类药物对于改善生活方式及使用口服降糖药物效果亦不佳时，方建议使用注射器或胰岛素笔等装置进行给药。同时，为了达到最佳的控制血糖的疗效，亦可将多种胰岛素按比例预混合后给药。对于患有ＩＩ型糖尿病的孕妇及哺乳期妇女，选择注射胰岛素的治疗方法相对于口服降糖类药物安全性较高。后者，即通过口服降糖类药物来控制血糖的治疗方法，其药物种类多为双胍类、噻唑烷二酮类、磺脲类、苯甲酸衍生物类及一葡萄糖苷酶抑制剂等。这些降糖药物的治病机制各不相同，如二甲双胍主要是通过减少肝脏中肝糖原转化成葡萄糖的能力，并增加肝脏、肌细胞及脂肪细胞吸收血液中多余葡萄糖来达到控制血糖的目的；对于罗格列酮等噻唑烷二酮类降糖药物，其作用机制主要是增强胰岛素敏感性，并且增加肝脏、肌细胞及脂肪细胞吸收血液中多余葡萄糖，进而有效的降低血糖浓度；格列美脲一磺脲类和瑞格列奈一苯甲酸衍生物的作用机制相似，分别刺激胰岛和胰腺分泌功能来产生更多的胰岛素，达到调节血糖的治疗效果：最后一种口服类降糖药阿卡波糖和伏格列波糖即Ｑ一葡萄糖苷酶抑制剂则是通过直接降低人体消化道吸收糖类的方式来降低餐后血广州中医药大学２０１４届项士学位论文糖控制病情。然而，过分依赖口服西药类降糖药和注射胰岛素等治疗糖尿病都会给患者身体带来严重的副作用和亦成为家庭经济负担。其中，磺脲类和胰岛素均会增加体重和增加患低血糖的风险，二甲双胍类和ｎ一葡萄糖苷酶抑制剂则会直接对消化道产生不良反应，噻唑烷二酮类亦能够引起水肿、增加心脏负担和骨折等风险。三、中医药治疗ＩＩ型糖尿病进展研究中医药学是中华民族的瑰宝，是异常珍贵的国医经典。毛泽东说过“中国医药学是一个伟大的宝库”。两千多年以前，在古希腊、罗马、埃及和中国，多尿、多渴等症状即被作为非常重要的病理学症状盥…。传统中医药这一独特的医疗诊断、治疗、保健方法体系已经有超过２０００年的历史，它的基本治疗方法包括针灸、艾灼、中药草方、食疗、气功和动静态疗法。在中国悠久的历史中，利用传统中医药手段治疗西医所谓的糖尿病复合症状有相当长的一段历史瞳们引。常规方法调节血糖是结合饮食控制、注射胰岛素、口服降糖药、减轻体重和运动的综合治疗方法来达到降低血糖的目的瞳。与此不同，中医药传统方法治疗糖尿病及其并发症则具有较为完善健康的临床实践经验和美好的前景乜”。从古至今中医药学治疗糖尿病遵循了先宏观脏腑辩证，再通过中草药方剂和其他辅助治疗手段并进的方式达到疗效的，这是与西医中人体解剖生理概念思维的不同之处险…。因此，古代治疗消渴证即西医中的糖尿病是利用这种独特的治疗方式。目前，传统的中医药和广义的中医药治疗手段在糖尿病和其他疾病的治疗方面吸引了全世界越来越多研究者们的







































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