Nature子刊报道超高活性胞嘧啶编辑器
2020-8-24 来源：不详 浏览次数：次刘云涛 https://m-mip.39.net/nk/mipso_4394487.html
目前已知人类大多数遗传病是由单碱基突变所导致的，因此如果能修复这种突变的单碱基，那么很多遗传病都可以得到有效的缓解与治疗。自从年和年，CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedPalindromicRepeats，成簇的规律间隔的短回文重复序列）技术被相继证明可以在原核细胞和真核细胞中进行精准而有效的基因编辑后，该方法迅速席卷整个科研界和工业界，给人们治疗遗传病带来无尽的希望。
简单来讲，CRISPR是细菌通过记录和精准攻击入侵病毒的DNA序列而进行自身防御的适应性免疫系统关键组成部分。科学家们利用该工具可以实现对细胞内DNA的编辑，基本原理是Cas9蛋白在特定sgRNA（smallguideRNA）的引导下，切割目标位点引入DNA双链断裂（double-strandbreaks，DSBs），之后经由非同源末端连接（Non-homologousEndJoining,NHEJ）或同源重组修复（Homologydirectedrepair,HDR）途径实现目标基因的编辑。
后来，为改善CRISPR-Cas系统基因组操作的准确性和效率，研究者开发出特异性更强的单碱基编辑系统——胞嘧啶碱基编辑器（cytidinebaseeditors,CBEs，可将C·G改变为T·A）和腺嘌呤碱基编辑器（adeninebaseeditors,ABEs，可将A·T改变为G·C），可在不引入DSBs的情况下诱导特定位点碱基的精准改变。从理论上而言，CBEs和ABEs可修复ClinVar数据库中80%以上的致病单碱基变异。但是与同源重组修复相比，单碱基编辑的编辑窗口更加局限。因此，如何优化单碱基编辑器成为了CRISPR领域中的研究热点之一。
年5月11日，华东师范大学刘明耀教授和李大力教授研究团队联合赛福基因科学家团队在Nature子刊NatureCellBiology（影响因子17.）杂志上发表文章Increasingtheefficiencyandtargetingrangeofcytidinebaseeditorsthroughfusionofasingle-strandedDNA-bindingproteindomain，开发了一系列超高活性胞嘧啶碱基编辑器——hyCBEs（hyperCBEs）。
由于CBEs主要是以单链DNA（ssDNA）作为底物，因此研究人员猜测是否可以通过融合序列非特异的单链DNA融合蛋白（ssDBD）来增加亲和力和编辑活性呢？为检测这一猜想，研究人员通过对10个非序列特异性的ssDNA结合结构域（ssDBD，包括RPA70，RPA32，BRCA2，HNRNPK的KH结构域，PUF60的RNA识别基序，RAD51的DBD结构域）与CBE进行融合，通过筛选，发现将Rad51蛋白的ssDBD融合到APOBEC1与Cas9n之间能显著提高碱基编辑活性，同时编辑窗口也大幅增加。与BE4max相比，融合了RAD51ssDBD的hyBE4max在编辑窗口C4-C8中的活性由10.2–47.7%提高到了15.4–69.6%，在靠近PAM的编辑窗口C9-C15的活性由4.7–22%提高到了15.35–44.7%。随后，研究人员将这一策略应用到了A3A-BE4max和eA3A-BE4max编辑器上，发现hyA3A-BE4max和hyeA3A-BE4max的编辑活性同样均得到了提高（如下图）。上述实验均是在体外细胞中做的，那这种改造后的编辑器在体内的应用如何呢？研究人员对小鼠胚胎进行了编辑，编辑基因为小鼠Dmd基因，同样发现了该工具在编辑效率、编辑活性和编辑窗口上均优于优化前的工具（如下图），另外，hyeA3A-BE4max活性比eA3A-BE4max提高了倍，且编辑窗口由C4-C9扩展到了C4-C15。
基因编辑工具具有潜在的脱靶风险（即本来要编辑A基因，但实际上却编辑了B基因），在操作中，脱靶风险越小，该基因工具也就越安全。为了检测优化的hyCBEs基因编辑工具脱靶情况如何，研究人员通过对潜在的脱靶位点进行高通量筛选，并没有发现明显的DNA或RNA水平上的脱靶现象或者DNA毒性（如下图）。
以上结果表明hyCBE编辑器不仅编辑活性提高，而且并没有增加DNA及RNA脱靶风险，那么这个基因编辑工具可否用于基因治疗呢？研究人员以β-血红蛋白病（如β-地中海贫血和镰刀形红细胞贫血症，该病由编码血红蛋白β亚基的单碱基突变所致）为模型对该编辑器进行了验证。研究人员通过比较多种CBE在编辑胎儿血红蛋白（HBG）启动子-位点的编辑能力发现，hyeA3A能在红细胞前体细胞系实现精确编辑，将G改变为A，而与周围同时发生碱基突变（bystandermutation）的细胞相比，具有更高的HBG表达水平，从而展示了优化后的hyeA3A-BE4max编辑器在治疗β-血红蛋白病上的巨大潜力（如下图）。
总之，研究人员通过融合RAD51的ssDBD结构域产生了一系列的高活性、高效率、高编辑窗口的碱基编辑器hyCBEs（hyBE4max,hyA3A-BE4max和hyeA3A-BE4max）。该工作为基础研究和临床治疗单碱基突变的疾病提供了更广泛的应用前景。
参考文献：
ZhangX,ChenL,ZhuB,WangL,ChenC,HongM,HuangY,LiH,HanH,CaiB,YuW,YinS,YangL,YangZ,LiuM,ZhangY,MaoZ,WuY,LiuM,LiD.Increasingtheefficiencyandtargetingrangeofcytidinebaseeditorsthroughfusionofasingle-strandedDNA-bindingproteindomain.NatCellBiol.May11.doi:10./s---8.Epubaheadofprint.PMID:.
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