二代测序应用于神经退行性疾病的机遇与挑战

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遗传因素在神经退行性疾病的发病机制中起着至关重要的作用，基因突变会导致多种孟德尔遗传病（如遗传性神经病、共济失调和癫痫），以及复杂性疾病（如偏头痛、自闭症、多发性硬化症和散发性癫痫等）。目前神经系统疾病常用的一些检查方法，例如脑电图（EEG）、计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET）等可以帮助医生对疾病做出诊断，但是由于神经系统疾病的复杂性，仅仅依靠这些影像数据很难准确诊断。始于上世纪70年代的Sanger测序仅局限于单一位点或单一基因的检测，而神经系统疾病往往又具有表型异质性（同一基因的不同序列发生突变可能导致不同的表型）和基因异质性（同一表型有可能是由不同的基因突变所导致）的特点，因此以高通量为特点的下一代测序（Next-GenerationSequencing，NGS，也称为二代测序）开始应用于神经系统的临床诊断。二代测序相比于Sanger测序具有通量高、耗时短、更经济、对嵌合体检测更准确等优势。近年来随着测序成本的下降，NGS在临床中的应用也越来越普遍。

年5月12日，土耳其Ege大学与伊朗Tabriz大学在NeuroMolecularMedicine杂志上发表了综述文章ApplicationofNext-GenerationSequencinginNeurodegenerativeDiseases:OpportunitiesandChallenges，讨论了二代测序在神经退行性疾病诸如阿尔茨海默病、帕金森病、癫痫和多发性硬化中的应用，以及二代测序技术所面临的机遇与挑战。

文章从二代测序的类型、步骤、与神经退行性疾病、机遇与挑战等五个方面展开论述。

二代测序的类型

目前，二代测序相关的基因检测项目主要包括三种：全基因组测序（WholeGenomeSequencing,WGS）、全外显子组测序（WholeExomeSequencing,WES）和基因包测序（GenePanel）。人的基因组由编码区（外显子）和非编码区（内含子、启动子、调控元件和结构元件等）组成，将这些遗传信息全部进行测序即全基因组测序；如果只对编码区进行测序，即全外显子组测序；如果只对部分基因进行检测，即基因panel测序。另外，还包括其他的检测项目，如RNA测序、基因组甲基化测序等。不同的检测项目应当依据不同的需求进行选择。

1.全基因组测序（WGS）

该方法的测序目标是整个基因组，包括核基因组和线粒体基因组。因此，该方法是最有效的基因检测方法之一。相比较于全外显子组测序，全基因组测序还能发现非编码区的基因突变。比如，毛细血管异常引起的小头畸形就有非编码区基因突变致病的可能，而此类变异正是WES无法检测出的。鉴于此，全基因组测序有可能成为一种全面评估神经系统疾病的方法。

2.全外显子测序（WES）

目前，WES已经应用于临床作为辅助诊断的工具，尤其是应用于孟德尔遗传病的诊断，其诊断成功率约为30%。诊断成功率受到诸多因素的影响，比如对于发病率较高的罕见病越早诊断，诊断成功率越高；有神经症状的人相对于没有临床症状的人，诊断成功率要高。在一项针对智力/生长迟缓患者的研究中发现，当患者出现特定神经症状（如癫痫时）阳性率会提高5%。以上发现表明神经系统疾病的发生与多个基因有关系。WES的缺点是不能检测到非编码区。因此，在临床诊断中要结合患者的实际情况进行选择。

3.基因包测序（GenePanel）

在许多神经退行性疾病中，基因型与表型之间的关系尚未完全研究清楚。如：共济失调和癫痫的许多症状存在重叠，不同基因可导致特定的临床表型。因此，需要一个有针对性的检测方法，即基因panel测序。该方法通常是对少量几个，且是某些疾病已知的致病基因进行测序。例如在对Limb-Girdle肌营养不良（LGMD）和先天性肌营养不良（CMD）致病变异的检测中，基因panel相比于单基因检测阳性率要高出3倍。虽然该方法检测的基因数量要低于WGS和WES，但是每一个基因的测序深度更深，因此不太可能会遗失某些突变。表1即为目前正在使用的一些基因panel。

表1

二代测序的步骤

二代测序可以分为三个步骤：建库、测序和数据分析。

建库：在这一步基因组DNA被打断成小片段，然后在每个片段后连接一段小的特定序列（即接头序列），再对这些片段进行扩增富集。

测序：将上述获得的文库转化为单链DNA，上机测序。由于单个分子碱基发出的信号不能被识别，所以需要对序列进行扩增。常用的扩增方式包括：桥式PCR和油包水PCR两种。

数据分析：测序过程会产生大量的数据，甚至包括一些质量不好的数据，因此，在分析利用数据之前需要先进行数据优化。不同软件的应用、不同参数的设定、测序结果的组装和比对等都决定了最后产出的数据质量。数据分析是疾病精准诊断的重要步骤之一。

二代测序与神经系统疾病

神经系统疾病的复杂性使得准确找到其背后的致病因素非常困难。高通量测序可以帮助医生和患者了解遗传因素，而且对于疾病诊断和治疗至关重要。

1.阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（Alzheimer’sDisease，AD）是一种进展性神经系统疾病，常发生在老年人身上，其发病机制复杂，被认为是由遗传、衰老和环境等因素引起的。遗传性和早发性阿尔茨海默病被认为与遗传因素相关。早发性阿尔茨海默病是指65岁之前发生的，目前已知至少有三个基因与其相关：APP、PSEN1和PSEN2。晚发性阿尔茨海默病是指65岁之后发生的，其遗传因素相对比较复杂。例如常见的突变类型APOEε4与阿尔茨海默病、帕金森病等疾病都有关系。此外，部分疾病由于临床症状相似，可能会导致误诊的发生，而基因检测有助于疾病甄别。

尽管目前已经发现了很多与阿尔茨海默病相关的基因突变，但是这些突变与阿尔茨海默病发病间的具体机制尚不清楚。通过NGS发现和挖掘新的基因突变对于进一步了解阿尔茨海默病至关重要。而且早期诊断该病可以提前进行干预，但是很多患者在早期并没有明显的临床症状，通过NGS可以早发现致病/易感基因携带情况。因此，二代测序在阿尔茨海默病中的应用具有广阔前景。

2.帕金森病

帕金森病（Parkinson’sDisease，PD）是由于神经元变性和多巴胺缺乏引起的一种常见的运动神经系统紊乱，会引起肌肉僵硬、不安、震颤、运动迟缓等症状。虽然PD的病因不明，但依然可以将其分为原发性或继发性。原发性帕金森病可能是遗传性或特发性的，而继发性帕金森病主要是由于环境因素所导致的。PRKN、PINK、ATP13A2和SNCA等基因被报道与PD的发病相关。鉴定与PD发病相关的基因有助于选择合适的治疗策略。

目前NGS相关研究发现帕金森病至少与以下基因有关：PARK1,PARK4/a-Synuclein,PARK5/UCHL1,PARK8/LRRK2,PARK11/GIGYF2,PARK13/Omi/Htra2——常染色体显性遗传；PARK2/Parkin,PARK6/PINK1,PARK7/DJ-1/PARK9/ATP13A2——常染色体隐性遗传。

3.癫痫综合征

癫痫综合征是一种以持续性发作为特征的神经系统性疾病，发病比例大约6/，每个人的终身发作风险约为3%。目前研究认为，70~80%的癫痫病例是由于遗传因素所导致的，其余的20~30%则是由诸如中风、肿瘤等因素所导致。癫痫可能由单基因突变所致，如与Dravet综合征相关的SCN1A基因突变，也可能由多基因突变所致。

NGS技术在癫痫综合征中的应用，极大提高了致病突变的发现概率。在年的一项利用基因panel（基因数量36~）对诊断率进行调查统计的研究发现，诊断率为10%~50%不等。目前，NGS已经取代核型分析和CMA成为癫痫综合征应用最广泛的基因检测技术。NGS作为强大的工具，在癫痫患者中的应用有助于发现新的癫痫基因、帮助临床识别更多样的疾病表型，辅助诊断和治疗。

4.多发性硬化症

多发性硬化（multiplesclerosis，MS）是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病。核磁共振是诊断该病的常见方法。该病可以分成炎症期和神经期两个阶段，通常从青春期开始，对髓鞘成分发生自身免疫性炎症，二代测序为及早诊断该病提供了可能。

研究表明，通过全基因组关联分析（GWAS）可以发现该疾病的易感基因，已有报道发现HLA与多发性硬化有关。一项WES研究发现部分MS患者中携带有CYP27B1突变（p.RH），该突变会导致基因功能的丧失。还有研究发现TYK2基因的rs位点与MS有关。但是，以上这些基因位点突变并不足以真正导致MS，而GWAS也可能无法识别出具有更大效应值的罕见变异。但是高通量测序毕竟为MS寻找新的相关基因提供了可能，而且这些新发现的基因可以为治疗MS患者提供新的、适当的治疗策略。

二代测序的机遇

二代测序具有通量高，价格低的优势，而且能够在诸如表观遗传、转录组、基因组等水平上提供遗传信息全景图，从而有助于我们了解疾病。全基因组和全外显子组有助于临床发现新基因或者新突变，而基因panel的优点是针对特定神经退行性疾病的特定基因进行测序，可以获得更深的测序深度，但是缺点之一是不能发现新的致病基因。通过NGS明确神经退行性疾病的致病突变，不仅可以帮助我们了解疾病发生原因，还可以辅助诊断甚至指导临床治疗，此外，还可以扩大我们对相关疾病表型的认识。

二代测序的挑战

二代测序在应用中也存在一定的挑战。第一个挑战即是样本浓度问题，一般来说高质量的DNA和RNA都是从越快冷冻处理的组织或血液中获得的。如果组织或血液低温处理有所延迟，那么对于DNA的质量影响并不大，但是对于RNA的质量就会有较大影响，从而影响基因表达的实验结果。此外，当循环DNA作为检测样本时，这些DNA在血浆中存在的片段太小（bp）。第三，与WES和WGS相比，基因panel不能发现新的基因。第四，每种疾病有其各自的特点，需要依据其特点和临床需求选择不同的测序方法，例如PMP22基因。60%以上的脱髓鞘性神经系统疾病是由PMP22基因突变所致，要检测该基因前需要先做PMP22基因的重复检测（MLPA检测），如果阴性然后再做WES。第五，在测序过程中，也需要注意假阳性问题。遇到阳性结果应当有验证。同时对于测序数据的解读也应当有专业人士进行解读，比如哪些基因与疾病发生发展有关、哪些基因与诊断有关、哪些基因与治疗有关，这些数据经专业解读后再交给临床医生。第六，如何做到全世界相关疾病的数据共享和完善也是NGS面临的一项重要挑战。

参考文献：

ShademanB,BirayAvciC,NikanfarM,NourazarianA.ApplicationofNext-GenerationSequencinginNeurodegenerativeDiseases:OpportunitiesandChallenges.NeuromolecularMed.May12.doi:10./s---7.Epubaheadofprint.PMID:.

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