课程回顾火热的基因治疗及其背后的腺相关病

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基因治疗是通过改变基因达到治疗的效果，目前已经不是一个概念，已有超过10个已经上市的基因治疗药物，而全球临床阶段的基因治疗项目有个，研发阶段的基因治疗项目超过抗体项目的两倍，成为目前药物研发的一大趋势和热点。

基因治疗中使用的AAV病毒，来源Science

按照治疗途径，基因治疗可以分为体内和离体两种类型，体内基因治疗是把基因直接转入到体内，从而达到基因治疗的目的。目前批准的大多数的基因治疗药物，是体内基因治疗。离体基因治疗是把细胞从人体取出，在体外进行基因改造，再回输体内达到治疗的目的，比如CAR-T和基因改造后的造血干细胞。

按照治疗机制，基因治疗又可分为转基因和基因编辑两种类型，目前获批的药物大都是转基因方法，基因编辑是新兴的方法，目前均处于研发阶段，未有获批的产品。

基因编辑与基因治疗

基因编辑是指把基因编辑的酶（CRISPR/Cas9/Talen或者ZFN）转入到细胞中，切断细胞中的DNA，DNA会利用修复机制把断开的染色体修复，其中最常见的修复叫非同源末端连接，在连接过程中经常会有碱基丢失或插入，这样往往会导致移码突变，最终结果是该基因被敲除。

另一种修复机制叫同源重组修复，在修复过程中根据引入供体的不同出现两种结果，如果引入的供体中有点突变，修复的结果就是引入点突变，如果供体中有一个基因，那么修复的结果就是插入基因。所以通常基因编辑的结果有三种，基因敲除，点突变和基因插入。这三种机制都可以用于基因治疗。针对以上三种基因编辑技术如何在基因治疗中应用，下面分别举例说明。01基因定点插入

B型血友病是因为9因子缺失造成的，在血友病患者中，9因子表达小于1%属于重型血友病，表达量介于1%和5%之间属于轻型血友病，大于5%属于正常人。

通过基因编辑技术，在B型血友病小鼠中插入表达9因子的cDNA，使老鼠正常表达9因子。结果如下图所示，低剂量组的老鼠表达9因子的水平也能达到5%的水平。另一个凝血时间试验表明，正常老鼠凝血时间20s，B型血友病老鼠凝血时间要1min，基因治疗后不管是高剂量组还是低剂量组，凝血时间都缩短到40s左右，具有显著的疗效。02基因敲除现在的CAR-T治疗多是自体CAR-T细胞治疗，虽然疗效好，但存在细胞培养难度大和病人等待时间长的缺点。而如果开发异体的CAR-T细胞治疗，能够在诊断后就直接输入人体，则会大大提高治疗效率，降低治疗成本。但是异体CAR-T也有挑战，主要集中在两方面，一方面是移植物抗宿主病（GVHD），异体CAR-T进入人体后会把病人的细胞当作异体，把病人的细胞杀伤，并且这种GVHD有时非常严重，可能致死。另一方面是免疫排斥，因为异体的T细胞进入人体，人体会把CAR-T当成外来物清除掉。通过基因敲除的方法能够解决这两方面的问题。以Allogene处于1期临床的异体CAR-T为例，对于GVHD的问题，只需要把CAR-T上的TCR敲掉，这样CAR-T就不能杀伤宿主细胞，但是仍然可以杀伤癌细胞。而对于免疫排斥的问题，需要分两步解决，一是输入一个靶向CD52的抗体ALLO-，该抗体能够与人体T细胞上的CD52结合，抑制T细胞的杀伤能力，使人体不会杀死CAR-T。二是把CAR-T上的CD52敲除掉，这样ALLO-只抑制宿主T细胞的杀伤能力，而不会抑制CAR-T的杀伤能力，从而达到减除免疫排斥的效果。目前这个项目的1期临床试验的效果非常好。03定点突变

以镰刀性贫血病为例，镰刀性贫血病和正常人的区别在于β血红蛋白上存在一个碱基突变，A变成了T。那么通过基因编辑技术引入一个有正常人DNA序列的模板就可以解决问题。

结果显示，用三个不同的含有正常人DNA序列的模板，能使10%以上的细胞表达正常的血红蛋白（紫色的是镰刀性贫血病的血红蛋白，绿色的是改造以后正常的血红蛋白）。而在临床上改造3%-10%的造血干细胞，就能达到明显的治疗效果。所以这一方法在理论上是完全行得通的。04碱基编辑

除了以上3种基因编辑方法以外，还有一个相对来说比较新的基因编辑技术，叫碱基编辑，用Cas9蛋白和脱氨酶蛋白的融合蛋白，引入细胞后，Cas9能够定点的把脱氨酶带到特定的位置，把C上的氨基脱掉变成U,在下一步的复制的过程中又会被当做T来复制。

所以通过这个过程就可以把碱基C变成碱基T，用同样的方法也可以把碱基A变成碱基G，目前这个技术现在用于好多单碱基变异的疾病，比如镰刀型贫血、地中海贫血、肝糖原累积病、抗胰蛋白酶缺乏症等。

基因治疗的载体

不管是通过转基因还是基因编辑，基因治疗都需要载体把DNA转到细胞中。载体可分为病毒载体和非病毒载体，现在最常用的基因转入的方式是病毒载体。以下是目前几种最常用的病毒载体，在选择病毒载体时着重